涇渭茯茶茶多糖對(duì)D-半乳糖衰老小鼠模型的抗衰老機(jī)制研究

史 敏，陳 雷，郭曉波，侯亞妮，孟婷婷，尚叢珊，封興華，鄭美玲

（1.西安培華學(xué)院 陜西 西安 710125；2.西安市中心醫(yī)院 陜西 西安 710003）

目前關(guān)于衰老被廣為接受的機(jī)制是1956年Harman[1]提出的“自由基學(xué)說(shuō)”，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為自由基對(duì)生物大分子的氧化是引起衰老的重要因素。自由基在其代謝失衡時(shí)所造成的生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸的氧化損傷則是導(dǎo)致機(jī)體衰老及心腦血管等疾病發(fā)生的共通點(diǎn)[2-3]。因此，異常的自由基反應(yīng)是促使衰老發(fā)生的根源所在，解決氧化難題成為延緩衰老的有效途徑。

茶是世界三大飲品之一，飲茶具有降血糖、調(diào)理胃腸、消脂減肥、抗癌抗氧化[4-6]等多種功效。茶葉中含有豐富的活性多糖物質(zhì)，統(tǒng)稱為茶多糖（Tea Polysaccharide，TPS），尤以粗老茶中的活性TPS含量最為豐富[7]。研究表明，許多植物中含有的多糖可通過(guò)直接清除自由基，提高超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量而發(fā)揮抗衰老作用[8-9]。涇渭茯茶作為陜西特有的地理標(biāo)志性產(chǎn)品，屬粗老茶類，因其飲用效果類似中藥茯苓而備受人們關(guān)注，目前的研究主要局限在茯茶活性成分的提取，茶多酚、茶色素化學(xué)成分分析或降血糖作用等方面[10-12]，有關(guān)茯茶中TPS抗氧化延緩衰老及降脂作用的研究報(bào)道較少。本研究觀察了茯茶TPS對(duì)D-半乳糖致衰老模型小鼠自由基的影響，揭示茯茶TPS延緩衰老的可能機(jī)制，從而為陜西茯茶的藥用及保健價(jià)值的開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康雌性昆明小鼠40只，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，2月齡，體質(zhì)量20～22g，普食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：茯磚茶（陜西省涇渭茯磚茶有限公司提供），生理鹽水，苦味酸，D-半乳糖，SOD、MDA、GSH-Px、羥基脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）試劑盒。

1.1.3 儀器及設(shè)備：電子分析天平、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、高速中藥粉碎機(jī)、透析設(shè)備、循環(huán)水式多用真空泵旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、純水蒸餾器、恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、勻漿器、微量進(jìn)樣器、小鼠灌胃器、高速低溫冰箱、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 茯茶TPS制備：茯茶TPS提取采用熱水浸提法。①將茯茶磨碎預(yù)處理，以1:60茶水比在85℃熱水中浸泡40min；②將浸泡液濃縮，80%乙醇沉淀、離心，沉淀物用少許水溶解，再重復(fù)乙醇沉淀，沉淀物分別用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚交替洗滌3次，水浴干燥，得到茶多糖粗制品（Crud Tea Polysaccharide，CTPS）；③CTPS純化采用Sevag法去蛋白質(zhì)，Sevag法連續(xù)5次后蒸餾水透析，24h后醇析，再真空冷凍干燥，得TPS純品。制備流程如下。

茯磚茶→粉碎→熱水提取→離心收集上清液→醇沉→濃縮水提液→CTPS→除蛋白→透析→醇析→冷凍干燥→純品TPS。

1.2.2 衰老模型建立：40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為4組，每組10只，即空白組、模型組、TPS低劑量組及TPS高劑量組。依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道方法[9]，除空白組外，其余各組小鼠每天頸背部皮下注射5% D-半乳糖溶液（0.25ml/10g體重）致亞急性衰老，共注射6周。注射D-半乳糖的第11天，測(cè)各組小鼠血清SOD和MDA含量。與空白組相比，小鼠血清SOD活性降低、MDA含量顯著增加，并伴有精神萎靡、行動(dòng)遲緩、記憶力減退，即為造模成功。

確認(rèn)造模成功后第2天開(kāi)始，TPS低劑量組及TPS高劑量組小鼠每日分別按0.5g/kg和1.0g/kg的劑量給予TPS溶液灌胃，每天1次；空白組和模型組每日灌服等體積生理鹽水。持續(xù)治療6周，每周禁食稱重1次。此外，每日將各組小鼠背部被毛剃去暴露皮膚(約2cm×2cm)，TPS低劑量組、TPS高劑量組小鼠均以含30%甘油的TPS提取液擦拭暴露皮膚，空白組和模型組采用生理鹽水擦拭，每組均早晚各1次，同樣持續(xù)治療6周。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 小鼠跳臺(tái)試驗(yàn)：末次給藥后，將小鼠置于跳臺(tái)儀中，10min后通電（36V），當(dāng)小鼠遇電擊后則跳上跳臺(tái)，記錄5min內(nèi)被電擊的次數(shù)和電擊后反應(yīng)時(shí)間，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。于環(huán)境中適應(yīng)24h后，將小鼠再次置于跳臺(tái)，直至跳下跳臺(tái)將其記為潛伏時(shí)間，并記錄3min內(nèi)的電擊次數(shù)，作為記憶成績(jī)。

1.3.2 小鼠胸腺和脾臟指數(shù)測(cè)定：末次給藥后，空腹24h稱重，用10%硫化鈉溶液脫去背部被毛，摘眼球取全血4～5ml放入肝素鈉管中待測(cè)。處死小鼠，取其胸腺、脾、肝及腦組織并稱重，根據(jù)公式計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體質(zhì)量(g)；脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體質(zhì)量(g)

1.3.3 茯茶TPS對(duì)衰老小鼠血清MDA含量及SOD活性影響：小鼠血液迅速于2℃～4℃離心30min后取血清，嚴(yán)格根據(jù)MDA和SOD試劑盒說(shuō)明書操作，分別于532nm和550nm測(cè)定各管吸光度，并計(jì)算血清中MDA含量和SOD活性。

1.3.4 茯茶TPS對(duì)衰老小鼠肝組織中GSH-Px和黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XOD）的影響：取小鼠肝臟，去肝內(nèi)結(jié)締組織，用勻漿器充分研磨，加生理鹽水制成10%組織勻漿。低溫離心30min取上清液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)GSH-Px和XOD活性。1.3.5 茯茶TPS對(duì)衰老小鼠腦組織SOD活性的影響：取衰老小鼠腦組織，加生理鹽水制成10%的組織勻漿，于2℃～4℃低溫條件下離心30min，取其上清液測(cè)定SOD活性。

1.3.6 茯茶TPS對(duì)衰老小鼠皮膚HYP含量的影響：去毛，取小鼠給藥部位的背部皮膚組織塊，去皮下結(jié)締組織和脂肪，生理鹽水漂洗，濾紙拭干，丙酮乙醚以1:1脫脂。精密稱取50mg，制成10%皮膚勻漿，凍融3次，待組織細(xì)胞內(nèi)容物完全游離于液相，低溫離心30min，取上清液測(cè)定HYP含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，行t檢驗(yàn)；組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察：造模21d后，模型組小鼠逐漸表現(xiàn)出精神倦怠、食欲不振、食量減少、反應(yīng)能力明顯降低、眼神黯淡、反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)緩慢、毛發(fā)稀疏無(wú)光澤且有脫落、皮膚松弛彈性下降等一系列的衰老癥狀，28d后這些癥狀更加明顯；而28d后，空白組、TPS低劑量組及TPS高劑量組小鼠反應(yīng)快、食欲好、精神狀態(tài)佳、眼睛有神、毛發(fā)光滑且有光澤、行動(dòng)敏捷、皮膚彈性良好。

2.2 小鼠跳臺(tái)行為學(xué)測(cè)試結(jié)果：由表1可知，空白組、TPS低劑量組和TPS高劑量組小鼠的跳臺(tái)學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間較模型組顯著縮短，且記憶潛伏時(shí)間顯著延長(zhǎng)，跳臺(tái)學(xué)習(xí)和記憶錯(cuò)誤次數(shù)也顯著減少（P＜0.05）。與模型組相比，TPS低劑量組小鼠和TPS高劑量組小鼠跳臺(tái)學(xué)習(xí)反應(yīng)時(shí)間分別縮短了9.22%和39.26%、錯(cuò)誤次數(shù)分別減少了12.78%和31.88%，記憶潛伏期分別延長(zhǎng)了16.93%和47.34%、錯(cuò)誤次數(shù)分別減少了11.15%和35.29%，TPS低劑量組和TPS高劑量組的改善幅度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。茯茶TPS可顯著增強(qiáng)衰老小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，且隨劑量的增大而增強(qiáng)。

2.3 胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果：由表2可知，與空白組相比，模型組小鼠的胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組相比，TPS低劑量組和TPS高劑量組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 小鼠胸腺和脾臟指數(shù)測(cè)定結(jié)果 （mg/g，xˉ±s）

2.4 血清MDA、SOD含量測(cè)定結(jié)果：由表3可知，與空白組相比，注射D-半乳糖6周后，模型組小鼠血清中MDA含量顯著增加(P＜0.01)，SOD活性顯著降低(P＜0.01)。與模型組相比，TPS低劑量組和TPS高劑量組小鼠血清MDA水平降低（P＜0.05，P＜0.01），SOD活性升高（P＜0.05，P＜0.01）。與TPS低劑量組相比，TPS高劑量組小鼠血清MDA水平降低（P＜0.05），SOD活性升高（P＜0.05）。說(shuō)明茯茶TPS可降低自由基代謝產(chǎn)物MDA，并且可提高血中SOD活性，且其效應(yīng)具有劑量依賴性。

表3 小鼠血清MDA、SOD含量測(cè)定結(jié)果 （xˉ±s）

2.5 肝組織XOD和GSH-Px含量檢測(cè)結(jié)果：由表4可知，與空白組相比，模型組小鼠肝組織XOD活性顯著升高（P＜0.01），GSH-PX活性顯著降低（P＜0.01），說(shuō)明D-半乳糖致衰老小鼠模型造模成功。與模型組相比，TPS低劑量組和TPS高劑量組小鼠肝組織XOD的活性降低（P＜0.05，P＜0.01），GSH-PX活性升高（P＜0.05，P＜0.01），且TPS高劑量組改善效果優(yōu)于TPS低劑量組（P＜0.05）。說(shuō)明茯茶TPS能降低XOD活性，提高GSH-PX活性，且存在劑量依賴性。

表4 小鼠肝組織中GSH-Px和XOD含量檢測(cè)結(jié)果 （U/mgprot,xˉ±s）

2.6 腦組織SOD活性和皮膚HYP含量測(cè)定結(jié)果：由表5可知，與空白組相比，模型組小鼠腦組織SOD活性顯著降低（P＜0.01），皮膚HYP含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，TPS低劑量組和TPS高劑量組小鼠腦組織SOD活性升高（P＜0.05；P＜0.01），HYP含量升高（P＜0.05；P＜0.01），且TPS高劑量組改善的效果優(yōu)于TPS低劑量組（P＜0.05）。見(jiàn)表5。說(shuō)明茯茶TPS可提高衰老小鼠腦組織SOD活性及皮膚HYP含量，并且隨TPS劑量增高，效果愈加明顯。說(shuō)明茯茶TPS能夠改善皮膚膠原蛋白代謝、促進(jìn)膠原蛋白合成，恢復(fù)衰老小鼠皮膚彈性具有一定的作用，且其作用具有劑量依賴性。

表5 小鼠腦組織中SOD活性和皮膚HYP含量 （xˉ±s）

3 討論

本研究采用連續(xù)皮下注射D-半乳糖，致實(shí)驗(yàn)小鼠細(xì)胞內(nèi)半乳糖持續(xù)增高，經(jīng)醛糖還原酶生成半乳糖醇而堆積于細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致自由基堆積，細(xì)胞損傷。進(jìn)而小鼠全身代謝紊亂，蛋白質(zhì)合成減少，導(dǎo)致肌肉萎縮、神經(jīng)元損傷和記憶力減退，建立亞急性衰老模型小鼠[13]。

SOD和GSH-Px可清除自由基，其活性決定了機(jī)體抗氧化能力的高低。因衰老模型小鼠體內(nèi)SOD和GSH-Px酶活性降低致使體內(nèi)自由基大量堆積，最終引起脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物MDA增加[14]。因此，細(xì)胞內(nèi)的MDA含量可反映細(xì)胞的衰老程度。研究開(kāi)發(fā)能夠清除體內(nèi)自由基、提高機(jī)體抗氧化能力的藥物已成為當(dāng)前抗衰老研究的熱點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，茯茶TPS高、低劑量組SOD活性顯著增加，MDA含量減少，說(shuō)明茯茶TPS具有清除機(jī)體自由基、減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的生成，保護(hù)細(xì)胞免受自由基損害而延緩衰老的作用。

GSH-PX是體內(nèi)有效清除自由基的一種酶，但在衰老機(jī)體中此酶活性會(huì)降低。XOD是核酸代謝中一種重要的酶，當(dāng)組織損傷時(shí)XOD催化黃嘌呤氧化產(chǎn)生大量的自由基，造成細(xì)胞、組織、器官?gòu)V泛損傷[15]。本研究中茯茶高、低劑量TPS作用于衰老模型小鼠后，肝組織中GSH-PX活性升高，而XOD的活性減弱，提示茯茶TPS可能通過(guò)提高小鼠肝組織中GSH-PX的活性和降低XOD的活性來(lái)增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，維持細(xì)胞膜正常的結(jié)構(gòu)和生理功能，發(fā)揮延緩衰老的作用。

脾臟、胸腺作為重要的免疫器官，對(duì)機(jī)體免疫功能的正常發(fā)揮起著非常關(guān)鍵的作用。脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)的上升則表明茯茶TPS具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。HYP是形成皮膚中膠原蛋白的一種特有氨基酸，在皮膚中含量高且較為穩(wěn)定。累積的自由基可引起膠原蛋白交聯(lián)、老化，使皮膚中的HYP減少，因此HYP水平可直接反映皮膚膠原蛋白的含量[16]。本研究結(jié)果顯示，茯茶TPS可升高衰老小鼠腦組織中SOD活性，而SOD可清除堆積自由基，起到抗氧化和維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能發(fā)揮抗衰老作用；TPS低劑量組和TPS高劑量組小鼠皮膚HYP含量均顯著增高，提示茯茶TPS可改善皮膚膠原蛋白代謝，促進(jìn)皮下膠原含量合成，延緩皮膚老化。

綜上所述，茯茶TPS可能是通過(guò)清除自由基及其代謝產(chǎn)物MDA、提高SOD和GSH-Px活性雙向調(diào)節(jié)作用延緩衰老的，而且其具有提高皮膚中HYP含量，增加胸腺、脾臟指數(shù)等作用。本研究為傳統(tǒng)茯茶的保健作用提供了依據(jù)，也為茯茶的進(jìn)一步藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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