計算機模擬和光譜法研究頭孢他美酯與胃蛋白酶的結(jié)合機理

劉保生， 王金菊， 陳 麗， 李志云， 馬麗花， 王春丹

(河北大學 化學與環(huán)境科學學院, 河北省分析科學技術(shù)重點實驗室, 國家級化學實驗教學示范中心(河北大學), 河北 保定 071002)

1 引 言

頭孢他美酯(Cefetamet pivoxil，CFP)為第三代半合成頭孢類抗生菌素，對多種β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，對革蘭陽性及陰性菌均有廣譜抗菌作用[1]。臨床上主要用于各種敏感菌所致的感染，如耳鼻喉、下呼吸道、尿路、皮膚和軟組織等[2]。

胃蛋白酶(Pepsin，PEP)分子量大約為35000，是Theodor Schwann在1836年發(fā)現(xiàn)的第一個動物酶，屬于天冬氨酸蛋白酶之一，是一種消化性蛋白酶[3]。PEP主要由生物體胃粘膜主細胞分泌，能有效地將食物中的蛋白質(zhì)分解為小的肽片段[4]。PEP可以作為助消化藥物，也可以用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。PEP作為人體消化系統(tǒng)中一個重要的蛋白酶，研究藥物小分子對PEP結(jié)構(gòu)的影響，對于醫(yī)學和生物化學均具有重要意義。目前，PEP與藥物的相互作用已有文獻報道[5-6]，但未見研究PEP與CFP之間作用機理的報道。因此，本文采用多種光譜法結(jié)合計算機模擬技術(shù)研究了不同溫度下PEP與CFP之間的結(jié)合機理，為CFP的藥理活性變化提供了理論依據(jù)。本研究有利于在分子層面探討藥物小分子與PEP的相互作用機制，進一步了解PEP的結(jié)構(gòu)和功能關系，為藥理毒性、藥效的深入研究提供必要數(shù)據(jù)支持。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

儀器：RF-5301PC熒光分光光度計；UV-3600紫外可見分光光度計(日本，島津)；pHS-3C型精密酸度計(上海雷磁儀器廠)；MOS-450/SFM300圓二色光譜儀(法國，Bio-Logic公司)；SYC-15B型超級恒溫水浴(南京桑力電子設備廠)。

試劑：頭孢他美酯標準品(CAS#，64485-93-4)，分子結(jié)構(gòu)式見圖1，配成濃度為1.0×10-3mol/L的水溶液，用時稀釋至所需濃度；胃蛋白酶(PEP純度≥99%，Sigma公司)，配成濃度為1.0×10-4mol/L的水溶液；Tris-HCl緩沖溶液(內(nèi)含0.15mol/L NaCl，pH=7.40)。實驗用水為二次石英蒸餾水，溶液均在4℃下避光保存。

實驗所測熒光強度均采用內(nèi)濾光效應公式[7]校正：

Fcor=Fobs×e(Aex+Aem)/2，

(1)

圖1 頭孢他美酯結(jié)構(gòu)式

式中，F(xiàn)obs為觀察到的PEP-CFP體系熒光強度，F(xiàn)cor為校正后的PEP-CFP體系熒光強度，Aex為CFP在激發(fā)波長處的吸光度值；Aem為CFP在發(fā)射波長處的吸光度值。

2.2 實驗方法

2.2.1紫外吸收光譜法

在298K溫度下，于10mL的比色管中依次加入1.0mL Tris-HCl緩沖溶液、2.0mL1.0×10-5mol/L的PEP溶液和不同體積的CFP溶液，用二次蒸餾水定容至5.0mL，恒溫水浴靜置30min(體系穩(wěn)定時間25～60min)，用相應濃度的CFP溶液作參比，測定PEP-CFP體系的吸光度，并繪制體系的紫外吸光度譜圖。

2.2.2熒光猝滅法與同步熒光法

在298，303，310K下，于一系列10mL比色管中依次加入1.0mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0mL1.0×10-5mol/L的PEP溶液及不同體積的CFP溶液，用二次蒸餾水定容至5.0mL，在恒溫水浴中放置30min。將配好的溶液置于1cm石英熒光池中，設定激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度為5nm，固定激發(fā)波長λex=280nm或295nm，分別掃描PEP-CFP體系的熒光光譜。同步熒光法按以上操作方法，固定波長差Δλ=15，60nm記錄PEP-CFP體系的同步熒光光譜。

2.2.3圓二色譜法

在298K溫度下，將1.0mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0mL1.0×10-4mol/L的PEP和不同濃度的CFP溶液依次加入10mL比色管中，用二次蒸餾水定容至5.0mL，搖勻，在恒溫水浴靜置30min，使用1mm石英池，記錄190～300nm范圍內(nèi)的PEP-CFP體系的圓二色譜圖。

2.2.4分子模擬

PEP的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:5PEP)來自蛋白數(shù)據(jù)庫(Protein data bank),CFP的結(jié)構(gòu)式在ChemDraw Pro14.0軟件中繪制，同時在ChemBio3D Ultra14.0軟件中對其三維結(jié)構(gòu)進行能量最小化。最后使用AutoDock4.2.6軟件對CFP和PEP進行分子對接，采用遺傳算法來計算與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物分子的可能構(gòu)象[8]。

3 結(jié)果與討論

3.1 PEP-CFP體系的紫外光譜

圖2為PEP-CFP體系的紫外光譜圖，PEP在205nm和280nm處有兩個吸收峰，205nm處的吸收峰是n-π*躍遷導致的，280nm處的吸收峰主要是由PEP中氨基酸殘基芳雜環(huán)π-π*躍遷所引起的[9]。由圖2可知，隨著藥物CFP的濃度增加，205nm處的吸收峰降低并發(fā)生紅移，280nm處吸收峰增加且發(fā)生藍移，這說明CFP的加入改變了PEP的構(gòu)象，PEP與藥物CFP間形成了新的復合物。

CPEP=4.0×10-6mol/L,1～6:CCFP=(0,1.0,4.0,6.0,10.0,20.0)×10-5mol/L

圖2PEP-CFP體系的紫外吸收光譜 (T=298K )

Fig.2Absorption spectra of PEP-CFP system (T=298K)

3.2 PEP-CFP體系的熒光光譜

298K時CFP對PEP熒光光譜的影響見圖3(a)(λex=295nm時的熒光光譜與其類似)，圖3(b)為PEP的激發(fā)光譜圖，由圖3(a)可知溶液中CFP濃度的不斷增加使PEP在340nm左右的熒光逐漸減弱，表明CFP與PEP之間存在相互作用。將猝滅數(shù)據(jù)按Stern-Volmer方程[10]處理：

I0/I=1+Kqτ0[L]=1+Ksv[L] ，

(2)

式中，I0、I分別為PEP溶液加入CFP前后的熒光強度，Kq為猝滅速率常數(shù)，[L]為猝滅劑的濃度，τ0為PEP分子熒光平均壽命(約為10-8s)，Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)。計算結(jié)果見表1。由表1可知，Kq值在不同溫度下均大于2.0×1010L·mol-1·s-1，且隨溫度升高，Ksv減小，表明PEP-CFP體系的結(jié)合過程是靜態(tài)猝滅過程[11]。用方程(3)[12]計算結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n：

(3)

其中，[Dt]為CFP的總濃度，[Bt]為PEP的總濃度。以lg(I0/I-1)對lg{[Dt]-n[Bt](1-I/I0)}作圖,根據(jù)曲線截距、斜率，得到體系的Ka以及n，結(jié)果見表1。由表1可知，n值均約為1，且溫度升高，Ka隨之減小，進一步詮釋了CFP與PEP的作用屬于靜態(tài)猝滅[13]。當λex=280nm時，可同時激發(fā)色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)殘基的熒光；當λex=295nm時，僅激發(fā)Trp殘基的熒光。由表1數(shù)據(jù)可以看出，同一溫度下，λex=280nm時的Ka值明顯大于λex=295nm時的Ka值，說明PEP與CFP間的結(jié)合位點來源于Tyr和Trp殘基。

CPEP=2.0×10-6mol/L,1～10:CCFP= (0,0.2,0.4,0.6,2.0,3.0,4.0,5.0,6.0,8.0)×10-5mol/L

圖3PEP-CFP的(λex=280nm)發(fā)射光譜(a)與PEP的激發(fā)光譜(b)

Fig.3Fluorescence emission spectra of PEP-CFP (λex=280nm) (a) and fluorescence excitation spectrum of PEP (b)

3.3 PEP-CFP體系的構(gòu)象研究

同步熒光光譜能夠提供蛋白質(zhì)熒光團的微環(huán)境信息，可以更加簡單有效地來測量熒光猝滅和最大發(fā)射波長可能發(fā)生的變化[14]。當Δλ=15，60nm時，同步熒光光譜分別反映出Tyr殘基、Trp殘基的光譜信息[15]。圖4為298K時的PEP-CFP

表1 不同溫度下CFP-PEP體系的猝滅反應參數(shù)

r1為方程I0/I～[L]的線性相關系數(shù)；r2為方程lg[(I0-I)/I]～lg{[Dt]-n[Bt](I0-I)/I0}的線性相關系數(shù)。

體系的同步熒光光譜，由圖4可知，隨著CFP濃度的不斷增大，Tyr殘基和Trp殘基的熒光均被猝滅，熒光峰明顯發(fā)生紅移。峰位置的改變說明CFP與PEP的相互作用改變了Trp和Tyr所在的微環(huán)境[16]。由于Trp和Tyr微環(huán)境的改變使得PEP腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增強，疏水性減弱，導致肽鏈變得松散，最終導致PEP的構(gòu)象發(fā)生了改變。

CPEP=2.0×10-6mol/L, 1～10:CCFP= (0, 0.2, 0.4, 0.6, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0)×10-5mol/L

圖4 PEP-CFP體系的同步熒光光譜。(a)Δλ=15 nm; (b)Δλ=60 nm。

Fig.4 Fluorescence spectrum of PEP-CFP system. (a)Δλ=15 nm. (b)Δλ=60 nm.

圓二色譜法(CD)被廣泛用來測定蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。PEP-CFP體系的CD譜如圖5所示。由圖5可知，在205 nm處有一個負的特征峰，為PEP中α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰[17]。當PEP與CFP的濃度比為1∶4和1∶8時，負峰逐漸減弱但峰位置和峰形沒有明顯變化，表明PEP二級結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)逐漸減少。通過計算可知，CFP的加入使得PEP的α-螺旋結(jié)構(gòu)從15.37%降低到12.83%。以上結(jié)果表明在CFP作用下，PEP中的α-螺旋結(jié)構(gòu)變得松散且蛋白的二級結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生改變，從而使得PEP熒光被猝滅，但是α-螺旋結(jié)構(gòu)仍占主導地位[18]。

CPEP = 2.0×10-5 mol/L; CCFP = (0.8, 1.6)×10-4 mol/L

Fig.5 Circular dichroism spectra of PEP-CFP system (T=298 K)

3.4 PEP-CFP體系的作用力類型及體系的結(jié)合距離

CFP和PEP結(jié)合反應的作用力類型可以根據(jù)CFP與PEP相互作用的熱力學參數(shù)進行推斷，ΔG、ΔS、ΔH等熱力學參數(shù)可由以下公式[19-20]得出：

RlnK=ΔS-ΔH/T，

(4)

ΔG=ΔH-TΔS，

(5)

計算結(jié)果見表2。由表2可知，ΔG<0，說明CFP對PEP的猝滅反應能自發(fā)進行；ΔH<0，ΔS>0，表明CFP與PEP間以靜電引力方式相互結(jié)合形成CFP-PEP復合物[21]。

表2 不同溫度下CFP-PEP體系的熱力學參數(shù)(λex=280 nm)

根據(jù)F?rster非輻射能量轉(zhuǎn)移理論[22],PEP與CFP之間的結(jié)合距離r、能量轉(zhuǎn)移效率E以及臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0(對應E=50%)三者的計算方程如下[23]：

(6)

(7)

(8)

其中，F(xiàn)0為PEP的熒光強度，F(xiàn)為PEP和CFP濃度為1∶1時的熒光強度;K2為取向因子，取PEP與CFP各向隨機分布的平均值2/3；N是溶劑的折射率，取水和有機物的平均值1.336；Φ為當無CFP存在時PEP的熒光量子產(chǎn)率，取PEP中色氨酸殘基的量子產(chǎn)率0.118[24]；J為PEP的熒光發(fā)射光譜和CFP的紫外吸收光譜的重疊積分；F(λ)、ε(λ)分別為在波長λ處PEP的熒光強度和CFP的摩爾吸光系數(shù)。計算所得PEP-CFP體系的結(jié)合參數(shù)見表3。從表3可以看出：r<7 nm，說明CFP與PEP間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移,使得PEP與CFP更容易發(fā)生能量傳遞[25]。此外，隨著溫度的升高，E值逐漸降低且r值逐漸增大，導致了PEP-CFP體系的結(jié)合穩(wěn)定性降低，結(jié)合常數(shù)減小，更進一步說明CFP與PEP之間存在靜態(tài)猝滅方式的相互作用。

表3不同溫度下PEP-CFP體系之間的結(jié)合參數(shù)

Tab.3 Binding parameters between PEP-CFP system at different temperatures

T/KE/%J/(cm3·L·mol-1)R0/nmr/nm2984．516．31×10-152．333．893034．176．18×10-152．323．913103．636．04×10-152．313．99

3.5 CFP的蛋白結(jié)合率

當?shù)鞍着c藥物結(jié)合達到平衡時，溶液中的蛋白主要有兩種存在形式：一部分以結(jié)合型蛋白存在，另一部分以游離型蛋白存在。在結(jié)合位點數(shù)n=1時，CFP的蛋白結(jié)合率(W)公式如下[26]：

W=

(9)

KaR[B0]W2-(KaR[B0]+Ka[B0]+1)W+

Ka[B0]=0,

(10)

式中，R為CFP與蛋白總濃度的比值。其中，蛋白濃度約為1.0×10-3mol/L，CFP濃度在1.0×10-7～1.0×10-3mol/L之間。利用實驗所得的Ka值和公式(9)分別計算λex=280 nm時，298，303，310 K溫度下CFP的蛋白結(jié)合率，結(jié)果分別為77.03%～93.60%、76.24%～93.11%、74.73%～92.13%。根據(jù)方程(10)繪制了結(jié)合率W與濃度比R的曲線圖，如圖6所示。

圖6 不同溫度下的CFP蛋白結(jié)合率(λex=280 nm)

Fig.6 Binding rate of CFP to protein in different temperature (λex=280 nm)

對310 K時的曲線進行非線性擬合得到方程：y=-0.13798x2-0.03236x+0.91914，r=0.999 3，即W=-0.13798R2-0.03236R+0.91914。

由圖6和上述方程可知，當體系中的蛋白濃度恒定不變時，隨藥物CFP的濃度不斷增大,其蛋白結(jié)合率逐漸降低。該研究為臨床合理用藥提供了重要的參考價值。

3.6 計算機模擬

計算機模擬技術(shù)廣泛地應用于分析蛋白與配體之間的相互作用，其目的主要是尋找底物分子和受體分子間的最佳結(jié)合位置[27]。PEP由327個氨基酸殘基組成，在結(jié)構(gòu)上，因含有Tyr、Trp和苯丙氨酸(Phe)而具有內(nèi)源熒光[28]。PEP的二級結(jié)構(gòu)有4個能明顯區(qū)分的區(qū)域，其中第一個區(qū)域是由6條反向平行鏈所組成的β-折疊結(jié)構(gòu)，從而形成了分子的骨架。β-折疊的形成進一步確立了PEP的催化活性位點[29]。通過分子對接軟件選取了PEP與藥物CFP最佳的結(jié)合位置，將對接數(shù)據(jù)處理可知，CFP與PEP的結(jié)合能ΔG為-23.88kJ/mol，這一結(jié)果與實驗所得的熱力學參數(shù)ΔG=-23.76 kJ/mol非常接近，從而更進一步證明CFP與PEP之間的相互作用。

圖7 CFP與PEP相互作用的分子對接圖。 (a) CFP與PEP發(fā)生作用區(qū)域；(b) CFP與PEP活化中心發(fā)生作用的氨基酸殘基。

Fig.7 Computation docking model of the interaction between CFP and PEP. (a)Binding site in the PEP cavity. (b) Detailed illustration of the amino acid residues lining the binding sitein the PEP cavity.

圖7為CFP與PEP分子對接最佳構(gòu)象圖，呈現(xiàn)出CFP藥物分子周圍的各種氨基酸殘基，CFP分子被氨基酸殘基Ser36、Asp215、Ile128、Ser35、Ile73、Asp32、Tyr75、Gly34、Thr74和Ala130所包圍。這一結(jié)果表明，CFP與PEP之間的作用力主要以靜電引力為主。這些氨基酸殘基中含有發(fā)色基團(Tyr75)，當CFP進入到PEP的疏水腔時，此時發(fā)色基團的微環(huán)境必然會受到影響，進一步說明CFP能有效地猝滅PEP的內(nèi)源熒光。

由圖7還可發(fā)現(xiàn)，CFP與Asp32和Asp215形成氫鍵，鍵長分別為0.187 7 nm和0.219 5 nm，表明CFP與PEP之間還存在氫鍵作用力。因此，計算機模擬建立的分子對接結(jié)果說明CFP與PEP之間主要是靜電引力作用同時還存在氫鍵作用力，CFP進入到PEP的疏水腔中改變了其周圍氨基酸殘基的微環(huán)境，因而造成PEP的熒光猝滅。

3.7 PEP與CFP相互作用的標準曲線

按照實驗方法，在298 K時加入不同濃度的CFP，考察體系熒光強度差值ΔF(ΔF=F0-F，其中F0、F分別為PEP、CFP-PEP體系的熒光強度值)與CFP濃度c的關系。結(jié)果表明：CFP濃度在2.0×10-6～ 8.0×10-5mol/L范圍內(nèi)與ΔF呈現(xiàn)良好的線性關系，線性回歸方程為ΔF=4.41×106c(mol/L)+27.3，相關系數(shù)r=0.997 4。按3σ/K求得該方法的檢出限為1.86×10-7mol/L(n=11)，表明利用CFP對PEP的熒光猝滅反應，可以實現(xiàn)對實際藥品中CFP含量的快速測定。

4 結(jié) 論

通過多種光譜法以及計算機模擬技術(shù)對CFP與PEP的相互作用進行了詳細的研究。結(jié)果表明，CFP和PEP結(jié)合使PEP內(nèi)源熒光發(fā)生有規(guī)律的靜態(tài)猝滅，且該過程伴有非輻射能量轉(zhuǎn)移發(fā)生。CD譜圖顯示CFP可以改變PEP的微環(huán)境，使其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。熱力學方程得到的熱力學參數(shù)與分子對接結(jié)果相符，進一步表明CFP與PEP的結(jié)合模式主要是靜電引力作用。該研究為藥物的研究發(fā)展提供了理論依據(jù)。

[1] WANG W, ZHU X M, WANG C M,etal.. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of oral and intravenous cefetamet in dog [J].Eur.J.DrugMetab.Pharmacok., 2015, 40(4):401-407.

[2] NOH K, KIM E, KANG W. Quantitative determination of cefetamet in human plasma by liquid chromatography-mass spectrometry [J].Biomed.Chromatog., 2011, 25(7):779-782.

[3] ASZMANN O C. The life and work of theodore schwann [J].J.Reconstrut.Microsurg., 2000, 16(4):291-295.

[4] GOLE A, DASH C, RAO M,etal.. Encapsulation and biocatalytic activity of the enzyme pepsin in fatty lipid films by selective electrostatic interactions [J].Chem.Commun., 2000, 16(4):297-298．

[5] 王藝潤， 方慶， 郭晨輝， 等. 光譜法和分子對接模擬技術(shù)研究托拉塞米與胃蛋白酶和胰蛋白酶的相互作用 [J]. 光譜學與光譜分析， 2016, 36(10):3414-3421.

WANG Y R, FANG Q, GUO C H,etal.. Probing the binding of torasemide to pepsin and trypsin by spectroscopic and molecular docking methods [J].Spectrosc.Spect.Anal., 2016, 36(10):3414-3421. (in Chinese)

[6] 廉淑芹, 楊冬芝, 鄭笑笑, 等. 應用熒光光度法研究加替沙星與胃蛋白酶的相互作用 [J]. 理化檢驗：化學分冊, 2013, 49(3):253-255.

LIAN S Q, YANG D Z, ZHENG X X,etal.. Study on interaction of gatifloxacin with pepsin by fluorospectrophotometry [J].PTCA(Part B:Chem.Anal.), 2013, 49(3):253-255. (in Chinese)

[7] WANG Q, HE J W, YAN J,etal.. Spectroscopy and docking simulations of the interaction between lochnericine and bovine serum albumin [J].Luminescence, 2015, 30(2):240-246.

[8] 王公軻, 閆長領, 盧秀敏, 等. 鹽酸環(huán)丙沙星與胰蛋白酶相互作用的光譜和分子模擬研究 [J]. 化學學報, 2009, 67(17):1967-1972.

WANG G K, YAN C L, LU X M,etal.. Study on the interaction of ciprofloxacin hydrochloride with trypsin by spectroscopic and molecular modeling methods [J].ActaChim.Sinica, 2009, 67(17):1967-1972. (in Chinese)

[9] ZHU S Z, LIU Y. Spectroscopic analyses on interaction of naphazoline hydrochloride with bovine serum albumin [J].Spectrochim.ActaA, 2012, 98:142-147.

[10] LIU Y Y, ZHANG G W, LIAO Y J,etal.. Binding characteristics of psoralen with trypsin: Insights from spectroscopic and molecular modeling studies [J].Spectrochim.ActaA, 2015, 151:498-505.

[11] TIAN Z Y, ZANG F L, LUO W,etal.. Spectroscopic study on the interaction between mononaphthalimide spermidine (MINS) and bovine serum albumin(BSA) [J].J.Photochem.Photobiol. B, 2015, 142:103-109.

[12] BI S Y, DING L, TIAN Y,etal.. Investigation of the interaction between flavonoids and human serum albumin [J].J.Mol.Struct., 2004, 703(1-3):37-45.

[13] 亓培培, 訾言勤. 頭孢他啶與胃蛋白酶相互作用的研究 [J]. 分析化學進展, 2017, 7(1):39-47.

QI P P, ZI Y Q. Investigation on interaction of ceftazidime with pepsin [J].Anal.Chem.Adv., 2017, 7(1):39-47. (in Chinese)

[14] ZHANG H M, CAO J, FEI Z H,etal.. Investigation on the interaction behavior between bisphenol A and pepsin by spectral and docking studies [J].J.Mol.Struct., 2012, 1021(4):34-39.

[15] ZHANG G W, CHEN X X, GUO J B,etal.. Spectroscopic investigation of the interaction between chrysin and bovine serum albumin [J].J.Mol.Struct., 2009, 921(1-3):346-351.

[16] QU L B, CHEN X L, YANG R,etal.. Investigation of the interaction between isoflavonoids and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy [J].Chin.J.Chem., 2007, 25(8):1151-1155.

[17] ZENG H J, YANG D, HU G Z,etal.. Studies on the binding of pepsin with three pyrethroid insecticides by multi-spectroscopic approaches and molecular docking [J].J.Mol.Recognit., 2016, 29(10):476-484.

[18] 崔萌萌, 劉保生, 李彤彤, 等. 頭孢噻肟鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白相互作用的光譜特征 [J]. 發(fā)光學報, 2016, 37(11):1415-1421.

CUI M M, LIU B S, LI T T,etal.. Spectral properties of the interaction between transferrin and cefotaxime sodium [J].Chin.J.Lumin., 2016, 37(11):1415-1421. (in Chinese)

[19] MOMENI L, SHAREGHI B, SABOURY A A,etal.. A spectroscopic and thermal stability study on the interaction between putrescine and bovine trypsin [J].Int.J.Biol.Macromol., 2017, 94:145-153.

[20] 陸從文, 蘭秀風, 張林, 等. 依巴斯汀與牛血清蛋白相互作用的熒光光譜研究 [J]. 光子學報, 2015, 44(10):1030004-1030009.

LU C W, LAN X F, ZHANG L,etal.. Interaction between ebastine and bovine serum albumin by fluorescence spectroscopy [J].ActaPhoton.Sinica, 2015, 44(10):1030004-1030009. (in Chinese)

[21] ZENG H J, LIANG H L, YOU J,etal.. Study on the binding of chlorogenic acid to pepsin by spectral and molecular docking [J].Luminescence, 2014, 29(7):715-721.

[22] KABOUDIN B, MORADI K, FAGHIHI M R,etal.. The fluorescence spectroscopic studies on the interaction of novel aminophosphinic acids with bovine serum albumin [J].J.Lumin., 2013, 139(7):104-112.

[23] ZHAO X C, LIU R T, TENG Y,etal.. The interaction between Ag+and bovine serum albumin: a spectroscopic investigation [J].Sci.TotalEnviron., 2011, 409(5):892-897.

[24] LI Z, LI Z G, YANG L L,etal.. investigation of the binding between pepsin and nucleoside analogs by spectroscopy and molecular simulation [J].J.Fluoresc., 2015, 25(2):451-463.

[25] SHEN L L, XU H, HUANG F W,etal.. Investigation on interaction between ligupurpuroside A and pepsin by spectroscopic and docking methods [J].Spectrochim.ActaA, 2015, 135(7):256-263.

[26] MATSUI H, OKUDA T. Penetration of cefpiramide and cefazolin into peritoneal capsular fluid in rabbits [J].Antimicrob.Agents.Chemother., 1988, 32(1):33-36.

[27] 賈悅, 楊洪芹, 郭劉奇, 等. 頭孢克肟與胃蛋白酶相互作用的光譜法研究 [J]. 化學研究與應用, 2016, 28(5):673-680.

JIA Y, YANG H Q, GUO L Q,etal.. Investigation of interaction between cefixime and pepsin by spectroscopic methods [J].Chem.Res.App., 2016, 28(5):673-680. (in Chinese)

[28] 曾華金, 李夢婷, 李晴, 等. 光譜法結(jié)合分子模擬技術(shù)研究左氧氟沙星與胃蛋白酶的相互作用機理 [J]. 發(fā)光學報, 2016, 37(4):481-486.

ZENG H J, LI M T, LI Q,etal.. Mechanism of interaction between levofloxacin and pepsin by spectroscopic and molecular docking methods [J].Chin.J.Lumin., 2016, 37(4):481-486. (in Chinese)

[29] ZHANG H M, CAO J, FEI Z H,etal.. Investigation on the interaction behavior between bisphenol A and pepsin by spectral and docking studies [J].J.Mol.Struct., 2012, 1021(4):34-39.