羅非魚-豆粕共沉淀蛋白的提取及溶解性、氨基酸組成分析

齊慧紅，周春霞，朱潘紅，李婷，洪鵬志

(廣東海洋大學 食品科技學院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學校重點實驗室，廣東 湛江，524088)

混合蛋白的研究引起國外學者的普遍關注，共沉淀蛋白(co-precipitates protein, CoPP)是指從一種或者多種原料中采用等電點沉淀、酸-熱沉淀或酸-熱誘導并輔以沉淀劑如CaCl2等方法得到的一種混合蛋白[1]。不同來源的蛋白質(zhì)制備的共沉淀蛋白，不僅在營養(yǎng)上可以實現(xiàn)氨基酸的互補[2]，而且具有良好的功能特性[3-5]和理想的感官特性[1,6]。大豆粉和花生粉提取的大豆-花生共沉淀蛋白在pH 2.5、5.0、7.0和9.0溶解時，在極端酸性pH 2.5條件下顯示溶解性最好，且高于單個大豆分離蛋白和花生分離蛋白的溶解性，大豆-花生共沉淀蛋白的亮度(L*)處于2種分離蛋白之間[7]；大豆-乳清共沉淀蛋白和棉籽-乳清共沉淀蛋白與單個分離蛋白相比，具有較高的溶解性、蛋白得率、蛋白評分及亮度(L*)[8]；在雞肉丸中添加不同配比7 S/11 S大豆球蛋白，可以顯著改善雞肉丸色澤、硬度和彈性等品質(zhì)[9]。此外，動植物蛋白直接混合制備的共沉淀蛋白，其產(chǎn)品品質(zhì)也有一定的改善效果，如將大豆分離蛋白添加于牛乳中，研制新型雙蛋白酸奶，研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)品營養(yǎng)互補均衡[10]。本研究結合羅非魚蛋白的營養(yǎng)優(yōu)勢[11]和大豆蛋白的功能特性優(yōu)勢[12]，以羅非魚肉和脫脂豆粕為原料，用pH調(diào)節(jié)法提取羅非魚-豆粕共沉淀蛋白，開發(fā)新型“雙蛋白”產(chǎn)品，并對其性質(zhì)進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

低溫脫脂豆粕，購于湖北荊州三菱湖小漁村(2017.2)，采用全自動凱氏定氮法(N×6.25)測得粗蛋白含量為(43.75±0.06)%，在實驗室經(jīng)萬能粉碎機粉碎后過100目篩備用；羅非魚(Oreochromisniloticus)，購于湛江水產(chǎn)市場(2017.2—2017.5)，鮮活迅速運回實驗室，取背部白肉，絞碎后分裝(500 g/袋)，于-20 ℃冷凍備用，采用全自動凱氏定氮法(N×6.25)測定粗蛋白含量(15.76±0.23)%。

Folin-酚蛋白定量試劑盒,購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司；其他試劑均為分析純。

PHSJ-4A型數(shù)顯pH計,上海雷磁儀器廠；EMS-4B磁力攪拌器,天津市歐諾儀器儀表有限公司；Avanti J-26sxp高效離心機,美國Beckman公司；VAP-450凱氏定氮消化爐和凱氏定氮蒸餾器,德國Gerhardf公司；EVO 300 PC紫外-可見分光光度計,美國Thermo Fisher Scientific公司；FDU-1100真空冷凍干燥機,日本托普儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羅非魚-豆粕共沉淀蛋白的提取[13]

羅非魚魚肉(使用之前取樣，室溫解凍)和脫脂豆粕粉分別按1∶1、1∶2和2∶1的質(zhì)量比混合(以干基計)，以不添加脫脂豆粕粉(1∶0)和不添加羅非魚肉(0∶1)為對照組→加冰蒸餾水[料水比=1∶9(g∶mL)]→均質(zhì)2 min→調(diào)pH值2～12(變化區(qū)間為0.5或者1個pH單位)，離心后收集上清液即為可溶性魚肉蛋白、大豆蛋白和共沉淀蛋白，采用全自動凱氏定氮法(N×6.25)測定樣品中粗蛋白含量，計算公式如下：

(1)

1.2.2 羅非魚-豆粕共沉淀蛋白的制備[13]

由1.2.1得到的上清液→調(diào)pH(可溶性魚肉蛋白等電點5.5，可溶性大豆和共沉淀蛋白等電點4.5)→離心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)→沉淀→加少量冰水分散，調(diào)pH 7.0→真空冷凍干燥→蛋白粉→真空包裝-20 ℃保存。

1.2.3 基本成分的測定

原料比按1∶0、1∶1、1∶2、2∶1和0∶1制備的蛋白粉分別記為羅非魚分離蛋白(FPI)、共沉淀蛋白(CoPP-1∶1、CoPP-1∶2、CoPP-2∶1)和大豆分離蛋白(SPI)。水分、灰分、粗脂肪的測定按GB5009—85進行，粗蛋白的測定采用全自動凱氏定氮法(N×6.25)。

1.2.4 羅非魚-豆粕共沉淀蛋白溶解度的計算

蛋白粉加一定量的冰蒸餾水，配制成濃度為5 g/L的蛋白溶液，用1 mol/L的NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)到相應的pH值，在4 ℃下磁力攪拌30 min，離心(10 000 r/min，20 min，4 ℃)，上清液中蛋白的含量用Folin-酚試劑盒定量測定[13]。

(2)

1.2.5 羅非魚-豆粕共沉淀蛋白度的測定

共沉淀蛋白的白度(whiteness)采用色差計，用L*值，a*值，b*值表示，每個樣品重復測定3次，取平均值[14]。按下式計算白度：

(3)

1.2.6 氨基酸組成分析

用6 mol/L HCl處理樣品，然后采用835-50日本日立型氨基酸分析儀測定水解氨基酸，再用4 mol/L LiOH處理樣品，采用同機測定色氨酸。氨基酸評分(AAS)、化學評分(CS)的計算參考1985年FAO/WHO推薦的營養(yǎng)品質(zhì)評價方法[15]：

(4)

(5)

1.2.7 統(tǒng)計分析

采用SPSS 13.0軟件，以p<0.05為差異進行顯著性分析。

2 結果分析

2.1 羅非魚-豆粕共沉淀蛋白提取條件的確定

不同pH值和原料比對可溶性蛋白溶解性的影響，如圖1所示。

圖1 pH值和原料比對可溶性蛋白溶解得率的影響Fig.1 Effect of pH value and raw material ratio on the solubility of soluble protein

在實驗范圍內(nèi)，可溶性魚蛋白、大豆蛋白和混合體系的可溶性共沉淀蛋白的溶解性隨pH值的變化趨勢基本一致，溶解曲線均呈現(xiàn)U型，類似于羅非魚[16]、大豆[17]的溶解曲線。原料比以1∶1、1∶2和2∶1提取的可溶性共沉淀蛋白和大豆蛋白均在pH 4.5時，蛋白的溶解得率最低，分別為13.79%、10.18%、15.17%和3.88%，沉淀得率最高(數(shù)據(jù)未列出)，而可溶性魚肉蛋白在pH 5.5時蛋白的溶解得率(16.99%)最低，沉淀得率最高(數(shù)據(jù)未列出)，主要是在等電點pH值范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)分子表面凈電荷幾乎為零，分子間的靜電斥力消失，水合作用最弱，分子容易聚集沉淀，溶解度降低[18]。偏離等電點的酸性和堿性pH范圍內(nèi)，可溶性蛋白得率呈現(xiàn)上升趨勢，且在極端酸堿pH 2.0、3.0、11.0、12.0達到最大值。這是因為酸性條件下，由于天門冬氨酸和谷氨酸的殘基的支鏈羧基所帶的負電荷被中和，所以蛋白分子帶有凈正電荷；堿性條件下，部分氨基酸的堿性集團，如精氨酸和賴氨酸的支鏈胍基或者氨基等發(fā)生了去質(zhì)子化反應，導致蛋白分子帶有凈負電荷，蛋白與水分子作用增加，蛋白溶解性也增大[19]。另外，在其他條件相同時，不同質(zhì)量比混合的原料得到的可溶性蛋白的溶解得率也不完全相同，在酸性范圍內(nèi)，如極端pH 2.0和3.0時，可溶性魚肉蛋白的溶解得率最高，在73%左右，其次是羅非魚肉和脫脂豆粕粉以質(zhì)量比(干基計)2∶1、1∶1和1∶2提取的可溶性共沉淀蛋白，但其溶解得率均低于70%。說明2∶1提取的可溶性共沉淀蛋白是魚肉蛋白占主要部分，故溶解得率接近于可溶性魚肉蛋白，而1∶2提取可溶性共沉淀蛋白是大豆蛋白占主要部分，故其溶解得率相比于其余2種共沉淀蛋白較低，1∶1提取的可溶性共沉淀蛋白的溶解得率處于中間，初步說明共沉淀蛋白組成既包含魚肉蛋白也有大豆蛋白。在極端pH 11.0和12.0時，2∶1制備的可溶性共沉淀蛋白的溶解得率高于70%，可溶性魚肉蛋白與1∶1、1∶2制備的可溶性共沉淀蛋白溶解得率差異不大，均在67%左右，可能是在酸性范圍內(nèi)，魚肉蛋白的水合作用占主導地位，在堿性范圍內(nèi)，則是大豆蛋白的水合作用占優(yōu)勢，以及魚肉蛋白與大豆蛋白的相互作用；由此設定提取共沉淀蛋白的、大豆蛋白和魚肉蛋白的最適酸溶pH為2.0和3.0，堿溶pH為11.0和12.0，等電點分別為pH 4.5、4.5和5.5。

2.2 羅非魚-豆粕共沉淀蛋白基本成分分析

可溶性魚肉蛋白(等電點5.5)、大豆蛋白和共沉淀蛋白(等電點4.5)在pH 2.0、3.0、11.0、12.0條件下溶解，再各自等電點沉淀，冷凍干燥制備羅非魚分離蛋白(FPI)、共沉淀蛋白(CoPP-1∶1、CoPP-1∶2、CoPP-2∶1)和大豆分離蛋白(SPI)等18種蛋白粉，分析其基本成分，見表1。

表1 羅非魚-豆粕共沉淀蛋白粉的基本成分 單位：%

注:不同的字母表示同一列差異顯著(p<0.05)。

由表1可知，不同pH溶解和不同pH沉淀制備的共沉淀蛋白的粗蛋白的含量均高于80%，與FPI和SPI粗蛋白含量相比，在pH 12.0條件下提取的CoPP-2∶1粗蛋白含量最高(89.55%)，其次是在pH 2.0條件下提取的CoPP-1∶1，為88.05%，主要是在極端酸堿條件下可回收大部分的肌原纖維蛋白和肌漿蛋白，只有少量的結締組織蛋白和膜結構蛋白沒有被回收利用[20]，故蛋白回收率較高。而在pH 3.0條件下提取的CoPP-1∶2的粗蛋白含量最低(80.42%)，可能是大豆蛋白在酸性范圍內(nèi)溶解性較差。表中FPI、SPI和共沉淀蛋白的粗脂肪含量均低于1.07%，且堿溶酸沉蛋白的脂肪含量低于酸溶酸沉蛋白，可能與實驗的方法及紗布過濾的操作有關。FPI的灰分含量相比于SPI較低，共沉淀蛋白灰分含量高于FPI而低于SPI，這一結果與張夢霞[13]的研究結果相似，且CoPP-1∶1比CoPP-1∶2和CoPP-2∶1的灰分含量低，表明原料按1∶1制備的共沉淀蛋白能更有效去除原料中Ca、Na等鹽類及其他不溶性物質(zhì)，可能是CoPP-1∶1中添加的豆粕粉含量低于CoPP-1∶2，造成大豆蛋白的含量相對較低，而CoPP-2∶1中魚肉蛋白占主要成分，使灰分含量也較高?？傊?，羅非魚-豆粕共沉淀蛋白的粗蛋白含量較高，適于做蛋白功能性質(zhì)的研究。

2.3 pH值對羅非魚-豆粕共沉淀蛋白溶解性的影響

圖2顯示FPI、CoPP-1∶1、CoPP-1∶2、CoPP-2∶1、SPI等18種蛋白粉在廣泛pH值條件下的溶解性。由圖2可知，pH值和原料比對蛋白的溶解性的影響比較明顯，在pH 4.0～6.0附近，蛋白的溶解度較低，當pH偏離該區(qū)域時溶解度迅速增加，在極端酸堿條件下，蛋白的溶解度達到最大，有的幾乎完全溶解，與大豆粉和花生粉提取的大豆-花生共沉淀蛋白的結果類似[7]，原理就是利用蛋白隨pH變化明顯的特點，在等電點附近，由于分子間靜電斥力的減小，蛋白迅速聚集沉淀，導致溶解度下降，達到最低，而偏離等電時，由于pH的作用蛋白帶上同種電荷，帶電的蛋白與水分子之間通過離子-偶極相互作用增強，從而增加了蛋白的溶解度[18-19]。從蛋白組成分析看，SPI的主要成分是水溶性球蛋白，在堿性范圍內(nèi)溶解性最好，主要是在此條件下蛋白分子展開度增加，水合作用增強，因此溶解度較高；CoPP-1∶2在堿性范圍內(nèi)的溶解度也較高，可能是原料比1∶2制備的共沉淀蛋白中大豆蛋白水溶性球蛋白增加，致使溶解度提高。FPI和CoPP-2∶1的溶解度在pH 7.0～8.0范圍內(nèi)低于CoPP-1∶1、CoPP-1∶2和SPI，可能是FPI的主要成分是鹽溶性蛋白，在堿性范圍內(nèi)，溶液中游離的電荷增多到一定程度，SPI所帶電荷被中和，雙層電荷遭到破壞，SPI分子從溶液中析出，造成共沉淀蛋白主要成分是魚肉蛋白的溶解度降低。不同的蛋白在相同pH值下的溶解度差別不大，但是堿提蛋白的溶解性較好，可能與酸溶過程中蛋白變性有關。總體而言，CoPP-1∶1和CoPP-1∶2在中性范圍內(nèi)可以改善其在水中的溶解性。

(a)、(b)、(c)、(d)、(e)分別表示FPI、CoPP-1∶1、CoPP-1∶2、CoPP-2∶1、SPI的溶解度圖2 pH值對共沉淀蛋白溶解性的影響Fig.2 Effect of pH on solubility of co-precipitates protein

2.4 羅非魚-豆粕共蛋白的色差分析

不同溶解-沉淀pH值條件下提取的蛋白粉，對其進行白度的測定，結果如表2所示。pH調(diào)節(jié)法回收了絕大部分蛋白，色素成分也可能隨著蛋白的提取而被提取出來，故SPI偏黃，另外，魚肉中的血紅蛋白在極端pH條件下發(fā)生氧化[21]，因此b*值較高可能是血紅蛋白和肌紅蛋白發(fā)生變性和氧化造成的結果[22]，而且樣品中脂肪氧化也會導致蛋白顏色變黃。SPI的白度最低，均低于63.20，添加魚肉后制備的CoPP-1∶1和CoPP-1∶2白度有所提高，且CoPP-2∶1的白度顯著提高，大約在72左右；比較而言，共沉淀蛋白的白度高于或者接近FPI白度，可能是共沉淀蛋白中魚肉蛋白(肌原纖維蛋白、肌漿蛋白、肌漿蛋白等成分)增加。總的分析結果說明共沉淀蛋白的白度優(yōu)于或者接近FPI和SPI，與大豆-乳清共沉淀蛋白和棉籽-乳清共沉淀蛋白的亮度高于單個分離蛋白的結果相似[8]。

2.5 羅非魚-豆粕共蛋白氨基酸組成分析和必需氨基酸評價

選取酸溶-酸沉(pH 2.0～4.5)/堿溶-酸沉(pH 11.0～4.5)制備的蛋白粉。表3列出了不同蛋白粉中常見的17種氨基酸組成，包含9種必需氨基酸(組氨酸為嬰兒必需氨基酸)，說明蛋白中氨基酸種類齊全，含有成人和嬰兒所需的必需氨基酸。參考FAO/WHO推薦的蛋白質(zhì)理想模式，優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)中必需氨基酸占總氨基酸的40%左右，必需氨基酸與非必需氨基酸比值在60%以上[15]。SPI中谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、色氨酸含量高于FPI，而FPI中賴氨酸、亮氨酸和丙氨酸等含量高于SPI，賴氨酸是人體第一必需氨基酸，在谷物蛋白中和其他一些植物蛋白中含量較低[23]，因此，魚蛋白可作為懶氨酸強化劑與植物蛋白復合使用，在營養(yǎng)上可以實現(xiàn)氨基酸的互補[2]。研究結果顯示羅非魚-豆粕共沉淀蛋白中必需氨基酸占總氨基酸的含量均大于40%，必需氨基酸與非必需氨基酸比值在70%以上，符合FAO/WHO推薦的蛋白質(zhì)理想模式，具有較好的營養(yǎng)性；與SPI和FPI相比，共沉淀蛋白的蛋氨酸、懶氨酸、甘氨酸和谷氨酸等含量處于兩者之間，如共沉淀蛋白的含硫氨基酸(蛋氨酸)含量雖然小于FPI，但與SPI相比，其含硫氨基酸(蛋氨酸)含量有了顯著提高，說明共沉淀蛋白可以取長補短，氨基酸平衡效果較好。另外，從原料的組成和pH變化可以看出，必需氨基酸和呈味氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸)含量從高到低依次是FPI>CoPP-1∶1>CoPP-2∶1>CoPP-1∶2>SPI，且堿提蛋白高于酸提蛋白，可能與蛋白的組成及變性程度?？傊?，共沉淀蛋白在營養(yǎng)上可以實現(xiàn)氨基酸的互補。

表2 不同蛋白粉的白度 單位：%

注：L*表示樣品的亮度；a*正值表示偏紅，負值表示偏綠；b*正值表示偏黃，負值表示偏藍。

表3 不同蛋白粉的氨基酸組成及含量 單位：g/100g(蛋白)

注：*表示必需氨基酸，TEAA：必需氨基酸總量，TAA：氨基酸總量，TNEAA：非必需氨基酸總量。

共沉淀蛋白的AAS、CS見表4。按照1985年FAO/WHO推薦的蛋白質(zhì)模式[15]，對于成人水平，pH調(diào)節(jié)法提取的蛋白AAS均大于1，滿足成年人對氨基酸需求水平。另外，按照嬰兒水平模式，F(xiàn)PS、SPI和共沉淀蛋白的第一限制性氨基酸均為組氨酸，AAS為0.45左右；FPI和共沉淀蛋白的第二限制性氨基酸為纈氨酸，AAS為0.68左右，而SPI的第二限制性氨基酸為蘇氨酸，AAS為0.60，因此共沉淀蛋白不能單純作為嬰兒食品的蛋白來源，但共沉淀蛋白中賴氨酸的AAS最高，已經(jīng)達到了標準模式的1.1倍左右。根據(jù)CS，除了賴氨酸達到標準，共沉淀蛋白的氨基酸評分普遍比雞蛋蛋白低，F(xiàn)PI和共沉淀蛋白的第一限制性氨基酸為組氨酸，SPI的第一限制性氨基酸為色氨酸。比較不同蛋白的評分，發(fā)現(xiàn)共沉淀蛋白的評分優(yōu)于或者接近FPI/SPI的評分。

表4 不同蛋白粉的必需氨基酸評價

3 結論

在極端酸堿(pH 2.0、3.0、11.0和12.0)條件下以羅非魚和脫脂豆粕為原料提取的共沉淀蛋白溶解得率較高；經(jīng)冷凍干燥制備的共沉淀蛋白，其粗蛋白的含量均高于80%，脂肪含量低于1.07%；pH對共沉淀蛋白溶解度的影響比較明顯，均在pH 4.0～6.0溶解性較差，而pH值低于4.0或高于6.0時，溶解度提高，且在極端酸堿pH范圍內(nèi)溶解度達到最大；共沉淀蛋白的白度較好，必需氨基酸種類齊全，且占總氨基酸的含量均大于40%，與SPI和FPI相比，共沉淀蛋白的蛋氨酸、懶氨酸、甘氨酸和谷氨酸等含量處于兩者之間，可見共沉淀蛋白實現(xiàn)了氨基酸互補；pH調(diào)節(jié)法提取的共沉淀蛋白AAS均大于1，滿足成年人對氨基酸需求水平，按照嬰兒水平模式，共沉淀蛋白的第一限制性氨基酸為組氨酸，其CS優(yōu)于或者接近FPI/SPI。因此，采用pH調(diào)節(jié)法可用于提取蛋白含量高和營養(yǎng)價值高的共沉淀蛋白。

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