新疆風干肉中優(yōu)勢乳酸菌的分離及產酶特性分析

李宇輝,郭安民，劉成江，王俊鋼*

1(新疆農墾科學院 農產品加工研究所，新疆 石河子，832000) 2(新疆農墾科學院，農產品加工重點實驗室，新疆 石河子，832000)

新疆的風干肉是新疆游牧民族的特色肉制品之一，其中以塔城風干肉最為有名。風干肉又分為風干牛肉、風干馬肉、風干羊肉。風干肉的制作時間多為秋季[1]，現宰的牛、羊、馬肉經過短時間腌制，自然發(fā)酵風干而形成，屬于發(fā)酵肉制品的一種。風干肉風味獨特，脂肪氧化、香辛料的添加及氨基酸的Strecker降解是新疆風干肉揮發(fā)性成分的主要來源[2]，而脂肪氧化和氨基酸降解與微生物的作用息息相關。KABAN分析了土耳其Pastirma在加工過程中的微生物變化，乳酸菌和氧化氨酶陽性球菌被推薦用作發(fā)酵劑去改善Pastirma的品質特性[3]。PETIT等人對南非的Biltong中的微生物進行了調査分析，主要的優(yōu)勢乳酸菌鑒定為腐生葡萄球菌[4]，優(yōu)勢的微生物產生各種酶類，分解脂肪和蛋白質，使之形成脂肪酸、小肽和氨基酸[5]，進一步氧化可產生閾值低的二甲基硫化物，對風味影響較大[6]。林偉濤等從煙臺中式發(fā)酵香腸中分離篩選出適合當地特色的、具有自然發(fā)酵香腸風味的微生物菌株，有德氏乳桿菌、食品乳桿菌、木糖葡萄球菌、米酒乳桿菌等，它們都具有很好的產酸和產酶特性[7]。

為了明確新疆風干肉發(fā)酵過程中乳酸菌的作用，本試驗采用傳統(tǒng)手段從新疆特色風干肉中分離獲得優(yōu)勢乳酸菌，并對其產乳酸脫氫酶、亞硝酸還原酶和酯酶的特性進行研究，為開發(fā)新疆風干肉專用發(fā)酵劑提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗原料及藥品

風干牛風和風干馬肉樣品：采自新疆塔城、阿勒泰地區(qū)。

還原型輔酶I(NADH)(優(yōu)級純)，法國生物梅里埃公司；甲基紫精(分析純)，上海美譜達儀器有限公司；α-酮戊二酸(分析純)，Biometra Tgradient；5′-磷酸吡哆醛(分析純)，蘇州凈化設備有限公司；對硝基苯酸酯(分析純)，上海申安醫(yī)療器械廠；NaCl(分析純)，寧波江南儀器廠；NaNO2(分析純)，德國 Eppendorf 公司。

1.2 儀器與設備

全溫振蕩器(HZQ-Q型)，哈爾濱東聯(lián)電子科技有限責任公司；紫外可見分光光度計(UV-1600)，上海美譜達儀器有限公司；PCR擴增儀(050-810 Tgradient 48)，Biometra Tgradient；凈化工作臺(SW-CJ-2FD)，蘇州凈化設備有限公司；立式蒸汽滅菌器(LDZX-40BⅠ型)，上海申安醫(yī)療器械廠；生化培養(yǎng)箱(XPX智能型)，寧波江南儀器廠；高速冷凍離心機(5415 D)，德國 Eppendorf 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 風干牛肉中優(yōu)勢乳酸菌的分離純化

將采自不同地區(qū)的風干肉樣品，取10 g在無菌條件下剪碎，放入90 mL滅菌生理鹽水，振蕩2 min，之后分別將樣品用無菌生理鹽水10倍、100倍、1 000倍稀釋[8]，備用。將稀釋液分別涂布在改良MRS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24～48 h[9]，將菌落在固體MRS培養(yǎng)基上劃線，直到鏡檢得到純菌株。將純菌株接種于固體MRS斜面培養(yǎng)基，4℃貯藏備用。

1.3.2 優(yōu)勢乳酸菌的鑒定[10]

1.3.2.1 形態(tài)觀察

對純化后的菌株接種在固體平板MRS上，觀察菌落形態(tài)，并利用革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)。

1.3.2.2 生理生化實驗

對純化后的菌株進行系列生理生化試驗，如運動性試驗、接觸酶試驗、葡萄糖發(fā)酵產氣試驗等。

1.3.2.3 菌體DNA的提取

采用CTAB法提取DNA[11]。

1.3.2.4 16S rRNA PCR擴增

采用細菌特異性引物，引物1為5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(E.colibase 8 to27)；引物2為5′-TACCTTGTTACGACTT-3′[12]，進行PCR擴增。將PCR產物純化送至上海生工測序。測序結果在NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)進行BLAST比對，采用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2.5 粗酶液的制備

將分離到的菌株在液體MRS培養(yǎng)基中活化，將種子液以2%接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基及添加亞硝酸鹽、酯、苯丙氨酸的MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)2～3 d。依據文獻[9]的方法做酶提取。

1.3.3 優(yōu)勢乳酸菌產酶特性分析

1.3.3.1 乳酸脫氫酶活性的分析

依據文獻[13]的方法進行測定。在反應體系中加入磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.4)2.8 mL，NADH(6 mmol/L)0.1 mL，丙酮酸鈉(30 mmol/L)0.1 mL，酶液20 μL，25 ℃水浴5 min，測定反應體系在340 nm處的吸光值(空白用磷酸鹽緩沖液)。酶活力單位定義：在本實驗條件下，每分鐘氧化分解1 μmol NADH所需的酶液為1個酶活力單位。

1.3.3.2 亞硝酸鹽還原酶活性的分析

[9]的方法。反應體系：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)1 mL+100 μL 0.1 mol/L NaCl+100 μL 0.1 mol/L NaNO2+100 μL 0.1 mol/L MV(甲基紫精)+0.1 mol/L Na2S2O4100 μL+20 μL酶液。37 ℃水浴10 min，反應體系為藍色，劇烈振蕩為無色后反應終止。取10μL液體，加入1 mL去離子水，加入20 μL 2 g/L鹽酸奈乙二胺溶液、40μL 4 g/L對氨基苯磺酸，待顯色穩(wěn)定后，于538 nm 測定吸光值(以磷酸緩沖液為空白)。酶活力定義：在本實驗條件下，每分鐘還原1μg亞硝酸鹽所需要的酶液為1個酶活力單位。

1.3.3.3 酯酶活性的分析

根據文獻[14]分析酯酶活力。反應體系：100 μL酶液加入到1.9 mL的底物緩沖液中，860 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)和40 μL 25 mmol/L對硝基苯乙酸酯，37 ℃水浴1 h，加入1 mL 95%乙醇終止反應。測定反應體系在410 nm處吸光值(空白用沸水浴10 min的酶液)。酶活力定義：在本實驗條件下，每分鐘還原1 μmol對硝基苯酚所需要的酶液為1個酶活力單位。

1.3.4 溫度對乳酸菌產酶特性的影響

將純化后的菌株在不同產酶培養(yǎng)基上接種，采用不同的溫度梯度(25、30、35、40、45 ℃)培養(yǎng)2～3 d，利用上述方法測定3種酶的活性。

1.3.5 數據統(tǒng)計

上述酶活力分析采用3次重復，使用SPSS18.0進行數據分析，p<0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 風干肉中優(yōu)勢乳酸菌的分離鑒定

從采集的樣品中分離得到3株優(yōu)勢乳酸菌，分別是tL-4，tL-7和aL-16，其菌落形態(tài)和生理生化試驗結果見表1。運動性試驗、接觸酶試驗、葡萄糖發(fā)酵產氣試驗、明膠液化試驗、甲基紅(M-R)試驗、吲哚試驗、產H2S試驗、乙酰甲基甲醇試驗(V-P試驗)均為陰性，tL-4、tL-7有較好的耐鹽性。

從風干肉中分離得到的3株乳酸菌，進行16S rRNA序列分析，所建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，tL-7與Lactobacilluscoryniformis有100%的同源性，tL-4、aL-16在基因序列對比中與Lactobacillusplantarum和Lactobacilluspentosus的同源性都達到了99%，但綜合生理生化特性分析，并結合《伯杰細菌鑒定手冊》[15]，可知菌株tL-7為棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)；tL-4為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，而菌株aL-16為戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)，雖與植物乳桿菌具有較好的同源性，但在理化性質上并不完全一致。因此對于菌種的鑒定生理生化分析與基因序列分析相結合，結果更為準確。

表1 菌株的形態(tài)和生理生化試驗結果

注：+：90%為陽性，-：90%為陰性，d：弱陽性。

圖1 風干肉中乳酸菌發(fā)育樹Fig.1 Phyogenetic tree of Lactic acid bacteria strains in Xinjiang air-dried meat

2.2 菌株的產酶特性分析

2.2.1 菌株的產酶活力

表2結果顯示，3 株菌的乳酸脫氫酶活性都較高，相比而言，tL-4和aL-16比tL-7有較高活性，分別為112.86 U/mL和94.62 U/mL。tL-4和aL-16的乳酸脫氫酶活性高，說明其發(fā)酵產酸能力較強，風干肉在發(fā)酵初期，需要乳酸菌產生大量乳酸，降低pH值，抑制雜菌生長。對于亞硝酸鹽還原酶活力，tL-4和aL-16都較高，tL-7的亞硝酸鹽還原酶活力較低，其中aL-16的亞硝酸鹽還原酶活力最高，為14.72 U/mL，乳酸菌中較高的亞硝酸鹽還原酶活力有利于降低風干肉在腌制和發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量。有研究表明，酸性環(huán)境有利于亞硝酸鹽的降解[16]，根據本研究，亞硝酸鹽含量的降低除了與酸性環(huán)境相關，同時也與優(yōu)勢菌有較高的亞硝酸鹽還原酶活力有關，亦或者是兩者共同作用的結果[17]。酯酶與風干肉風味物質的形成息息相關，試驗菌株tL-7的酯酶活力較高為13.25 U/mL，tL-4的酯酶活力為11.45 U/mL，而aL-16的酯酶活力相對較低9.67 U/mL。

表2 菌株的3種酶活力測定

單位：U/mL

注：同一欄中字母不同者表示有顯著性差異(p<0.05)

2.2.2 溫度與酶活的關系

試驗設計3株乳酸菌在不同溫度梯度(25、30、35、40、45 ℃)下的產酶特性分析，結果如圖2。3株菌產乳酸脫氫酶的最適溫度分別為30、35、40 ℃，其中tL-4產乳酸脫氫酶酶活力最強時溫度為30 ℃，tL-7的為35 ℃、aL-16的為40 ℃。圖3中3株菌產亞硝酸還原酶的最適溫度分別為30、35 ℃，其中tL-4產亞硝酸還原酶的最適溫度為35 ℃，tL-7的最適溫度為30 ℃。三者相比，aL-16產亞硝酸還原酶活力最強，此時的溫度為30 ℃，圖4中3株菌產酯酶的最適溫度分別為40、35、30 ℃，其中tL-4產酯酶的最適溫度為40 ℃、tL-7產酯酶的酶活最強，此時溫度為35 ℃、aL-16產酯酶能力相比tL-4、tL-7弱，酶活相對低，同時溫度在30～35 ℃酶活無差異。

圖2 溫度對3株菌產乳酸脫氫酶的影響Fig.2 Effect of temperature on the lactic dehydrogenase of three strains

圖3 溫度對3株菌產亞硝酸還原酶的影響Fig.3 Effect of temperature on the nitrite reductase of three strains

綜合圖2、圖3、圖4，3株乳酸菌的最適產酶溫度不同，同一菌株，產不同酶的最適產酶溫度也不同；3株菌在不同溫度梯度條件下的產酶特性也不同。tL-4產乳酸脫氫酶的溫度是30 ℃，亞硝酸鹽還原酶的最適溫度在35 ℃，產酯酶的最適溫度在40 ℃；tL-7的產酯酶在35 ℃出現最高值(12.53 U/mL)；aL-16在30 ℃產亞硝酸還原酶達到最高值(21.93 U/mL)。3株菌在30～40 ℃時產酶能力強，酶活力高，超出這個溫度范圍，產酶量變少、酶活變弱。

圖4 溫度對3株菌產酯酶的影響Fig.4 Effect of temperature on the esterase of three strains

3 討論

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenases，LDHs)是乳酸菌利用碳源轉化丙酮酸為乳酸的關鍵酶。有研究者從枯草芽孢桿菌和釀酒酵母中分離純化乳酸脫氫酶，并將其用于降低啤酒中高級醇的生成量[18-20]。風干肉中因為有乳酸脫氫酶，使得乳酸能夠在肉中大量積累，降低肉的pH值，抑制雜菌生長，同時乳酸還可以參與酯化、聚合等反應，對于風干肉中風味物質的形成起著重要作用。

研究發(fā)現，植物乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、泡菜乳酸菌等許多乳酸菌都有降解亞硝酸鹽的性質[21-22]。YAN等從泡菜中分離出1株乳酸菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，對亞硝酸鹽降解率高達90%[23]。國內也有研究在各種腌菜和養(yǎng)殖污泥中分離得到乳酸菌，具有降解亞硝酸鹽的功能[24-25]。本實驗中的戊糖乳桿菌和植物乳桿菌能夠高產亞硝酸鹽還原酶，有利于風干肉中亞硝酸鹽的降解，酯酶是一類能夠催化酯鍵斷開和形成的水解酶，廣泛存在于動物、植物和微生物中，能夠參與水解反應、轉酯反應、酯化反應等[26-29]，是風味物質形成的重要環(huán)節(jié)。風干肉中酯酶的活躍，促進了風味物質中酯類物質的形成，對于高產酯酶的菌株tL-7后期研究也可以考慮經過誘變或者其他技術提高酯酶活力或者產酯酶量，來增加風干肉的產品的品質和優(yōu)勢風味物質含量。

3種酶在風干肉的發(fā)酵和風味物質的形成過程中起著至關重要的作用，乳酸脫氫酶是微生物發(fā)酵產生乳酸的前提，而乳酸也是風味物質的前體，酯酶影響著風干肉中風味物質的形成，在風干肉的發(fā)酵過程中3株優(yōu)勢乳酸菌產生的幾種酶相互協(xié)調影響，對產品最終風味的形成具有重要作用。

4 結論

本研究主要針對新疆風干肉中優(yōu)勢乳酸菌進行了分離鑒定，通過菌株的生理生化和16S rRNA對比結果分析，新疆風干牛肉中的優(yōu)勢乳酸菌有植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis)、戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)。同時對于菌種的鑒定，生理生化分析與基因序列分析結果相結合，對于菌種的鑒定更為準確。

3株優(yōu)勢菌株的產酶特性，在不同溫度下的產酶活力不同，同一菌株產不同酶的最適產酶溫度不同，當溫度在30～40 ℃范圍內，菌株產各種酶的能力相對較強，3種酶活力也相對較高。

本研究只針對溫度對于酶活力的影響做了簡單分析，對于優(yōu)勢乳酸菌對風干肉品質形成和風味物質的產生并未進行系統(tǒng)研究，下一步可以根據本試驗結果對風干肉中的微生物發(fā)酵劑制定組合配方并研究其對風干肉品質和風味物質形成的影響，同時對實驗中篩選出來的產酶菌種進行應用研究，觀察其在不同底物濃度不同實驗條件下，產酶能力的變化，確定最適底物和最佳作用條件，使其盡快用于生產實踐中。

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