Lys490飽和突變提高海藻糖合酶轉化率的研究

呂鑫,王騰飛,汪俊卿,劉洪玲,王瑞明*

1(齊魯工業(yè)大學 生物工程學院，山東 濟南，250353) 2(天津科技大學 生物工程學院，天津，300222)

海藻糖是自然界中天然存在的一種非還原性二糖，是麥芽糖的同分異構體，由兩分子的葡萄糖通過α,α-1,1-糖苷鍵連接構成[1-2]。在細菌、真菌、昆蟲和一些無脊椎動物中都發(fā)現(xiàn)了海藻糖的存在[3-5]，其主要功能是作為儲能物質和細胞壁的組成成分[6-7]。隨著研究的不斷深入，海藻糖在食品、藥品、化妝品及農業(yè)領域得到了廣泛的應用[8-9]。

海藻糖合酶(Treshalose synthase， TreS)能夠專一性水解麥芽糖生成海藻糖[10]，其底物專一性強，為廉價的麥芽糖[11]。目前已經(jīng)有多種來源的海藻糖合酶基因被發(fā)現(xiàn)并進行了異源表達，但TreS轉化底物麥芽糖生產海藻糖的轉化率較低，因此，對海藻糖合酶進行分子改造是非常必要的。目前，有3種不同來源的TreS進行了結構解析，分別是來源于Deinococcusradiodurans(PDB ID:4tvu)[12]、Mycobacteriumtuberculosis(PDB ID:4lxf)[13]、Mycobacteriumsmegmatis(PDB ID:3zo9)[14]的海藻糖合酶。TreS屬于糖苷水解酶13家族(GH13)，包含ABC 3個結構域，其A結構域內的(α/β)8桶狀區(qū)域是催化主體結構，其內部主要由兩個天冬氨酸(Asp)和一個谷氨酸(Glu)構成催化三聯(lián)體[12]。相比隨機突變，通過同源建模得到蛋白質的預測結構，結合分子對接技術及氨基酸序列比對方法，理性設計突變位點，能夠在較小的突變庫中得到性質提高的突變體，被廣泛應用于蛋白質分子改造[15-16]。目前有多種來源的TreS通過分子改造提高了酶的特性，如李珍珍等人對來源于PseudomonasstutzeriQLU3的海藻糖合酶進行結構預測及分子對接，發(fā)現(xiàn)底物進出通道是海藻糖合酶反應的限速步驟，通過改變通道大小，將底物進出口的一些氨基酸定點突變后，得到一個轉化率提高4.5%的突變體[17]。宿玲怡等人通過多序列比對和同源建模的方法，將來源于Thermusthermophilus的TreS活性中心保守區(qū)附近的氨基酸突變后，突變體轉化率達到62%比原始酶提高13%[18]。

本研究室篩選得到的PseudomonasputidaP06，其產生的海藻糖合酶溫度和pH耐受性比較強，在40 ℃以下，pH 8.0～9.0條件下表現(xiàn)出較高的酶活[19]。通過基因工程手段，已經(jīng)將該TreS基因成功導入到大腸桿菌中，使蛋白表達量得到大幅提高[20]。但因該酶的轉化率難以滿足工業(yè)化生產的需要，因此有必要通過蛋白質工程手段改造TreS提高其酶促反應的轉化率。本實驗通過同源建模得到海藻糖合酶的預測結構，并與底物麥芽糖進行了分子對接，結合多序列比對結果，構建飽和突變庫，篩選得到了轉化率提高的突變體并對突變體的酶學性質進行了研究，為下一步海藻糖合酶的改造和工業(yè)化應用提供了實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

E.coliDH5α(含pET-15b-TreS質粒)為本實驗室前期構建；E.coliBL21(DE3) 超級感受態(tài)細胞為克隆表達宿主菌，購自Vazyme公司。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

2xPhanta?Max Master Mix購自Vazyme公司；Dpn I限制性內切酶購自Takara公司；TaqDNA聚合酶購自Thermo Fisher Scientific公司；DNA Marker、質粒提取試劑盒購自北京艾德萊生物有限公司；其他試劑為國產分析純。

培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L，用于大腸桿菌的培養(yǎng)及誘導。LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎上添加20 g/L瓊脂粉。

1.1.3 儀器

Veriti PCR儀；上海知楚ZQZY-CS恒溫振蕩培養(yǎng)箱；美國SONICS超聲破碎儀；日本島津LC-20A高效液相色譜。

1.2 海藻糖合酶及突變酶的結構分析和同源序列比對

利用I-TASSER進行TreS的三維結構預測，模板為來源于Mycobacteriumtuberculosis的海藻糖合酶H37Rv (PDB登錄號：4LXF_A)[13]。TreS與底物麥芽糖的柔性對接利用AUTODOCK4.0軟件進行，結構分析及突變位點預測通過PyMOL v1.6軟件完成。利用DNAMAN6.0軟件進行氨基酸序列比對分析。通過分析TreS突變前后氨基酸性質變化、疏水相互作用等，分析突變對轉化率的影響。

1.3 全質粒PCR法構建飽和突變庫

定點飽和突變采用全質粒PCR方法進行，以提取自E.coliDH5α的PET-15b-TreS質粒為模板，以含簡并引物的 LYS490-F、LYS490-R為引物，引物序列見表1。利用2×Phanta?Max Master Mix高保真聚合酶進行突變質粒擴增，其中PCR反應體系為：2×Phanta?Max Master Mix 25μL，上下游引物各2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補齊至50 μL。PCR反應程序為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，68 ℃ 8 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應結束后，取5 μL產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 LYS490飽和突變引物

注：下劃線序列代表突變氨基酸密碼子序列: N=A/T/C/G, K=G/T

將得到的PCR擴增產物利用Dpn I內切酶消化30 min，模板質粒是經(jīng)dam甲基化修飾的對Dpn I敏感而被切碎。酶切產物轉化E.coliBL21(DE3) 超級感受態(tài)細胞，轉化液涂布于含50 μg/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，隨機挑取單克隆至含1 mL LB培養(yǎng)基(含100 μg /mL 氨芐青霉素)的甘油管中，過夜培養(yǎng)，構建飽和突變體庫，庫容96個。

1.4 突變體庫的誘導表達

將突變體接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL 氨芐青霉素)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600 nm達到2.5～3.0時，添加誘導劑乳糖至終濃度4 g/L，27 ℃，200 r/min條件下誘導8 h。發(fā)酵液于4 ℃，8 000 r/min條件下離心10 min，5 mL 10 mmol/L PBS(pH 8.0)重懸菌體，利用超聲破碎儀提取突變酶，破碎條件：300 W，工作時間5 s，間歇5 s，全程15 min。破碎液4 ℃，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，上清液用0.22 μm濾膜過濾除菌。

1.5 突變酶活性檢測及轉化率計算

取5 mL粗酶液轉化底物濃度300 g/L的麥芽糖溶液(pH 8.0)，25 ℃條件下反應8 h，沸水浴15 min終止反應。室溫13 000 r/min離心15 min，取上清利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography ，HPLC)檢測轉化體系中海藻糖、葡萄糖、麥芽糖含量。同一突變子重復3次，測定值差異小于5%，取平均值。

HPLC測定方法：色譜柱Inertsil NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相(乙腈∶水=3∶1)；流速(1.0 mL/min)；檢測器：示差折光檢測器；進樣量10 μL；柱溫40 ℃。

海藻糖合酶轉化率計算公式：

(1)

其中，mtrehalose、mglucose、mmaltose分別代表轉化體系中海藻糖、葡萄糖、麥芽糖的質量。

1.6 突變酶最適溫度及熱穩(wěn)定性分析

分別在不同溫度(20～65 ℃)下，pH 8.0轉化1 h，以最高酶活為100%，測定原始酶與突變酶的最適反應溫度。分別在不同溫度(20～65 ℃)下保溫60 min后，25 ℃、pH 8.0條件下轉化1 h，測定剩余酶活力，比較原始酶與突變酶的熱穩(wěn)定性。

海藻糖合酶酶活力定義：每小時轉化麥芽糖生成1 μmol的海藻糖所需的酶量定義為1個酶活單位(U)。

1.7 突變酶最適pH及pH耐受性分析

分別在不同pH(4.0～10)條件下，25 ℃轉化1 h，以最高酶活為100%，測定原始酶與突變酶的最適反應pH。分別在pH(4.0～10)條件下，25 ℃保溫60 min后25 ℃、pH 8.0條件下反應1 h，計算剩余酶活力，比較原始酶與突變酶的pH穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 TreS活性中心分析及飽和突變位點的選擇

通過模擬預測的海藻糖合酶的三維結構(如圖1-a所示)，其活性中心與來源于Mycobacteriumtuberculosis的海藻糖合酶一致，包含1個(α/β)8桶狀催化區(qū)域，依據(jù)相關文獻報道，位于該口袋底部的氨基酸殘基是參與底物結合和親核催化的關鍵氨基酸[21]。為進一步分析TreS的活性中心，通過AUTODOCK 4.0進行小分子配體與酶的柔性對接，對接結果如圖1-b所示。通過PyMOL軟件分析酶-底物對接結果，發(fā)現(xiàn)海藻糖合酶活性中心的9個氨基酸(D294、E338、D403、D112、F115、F223、F255、Q259、R535)參與底物結合，前期研究發(fā)現(xiàn)，D294可能是參與親核催化的關鍵氨基酸[22]。

活性中心附近的氨基酸，雖然不直接參與底物結合和催化反應，但其對催化過程起到很大的輔助作用，并在酶促反應過程中，對酶的構象變化起到一定作用。通過分析TreS活性中心4 ?范圍左右的氨基酸(圖2-a)，發(fā)現(xiàn)490位賴氨酸位于活性中心附近，靠近可能的催化位點Asp294，并且其位于α螺旋末端，與α螺旋上H493、L494和底物麥芽糖形成4個氫鍵，其空間位置如圖2-b所示。

a-圖中黑框所示活性中心區(qū)域；b-活性中心參與麥芽糖分子結合的氨基酸殘基圖1 TreS的三維結構及分子對接結果Fig.1 Three-dimensional structure of TreS and the molecular docking results

a-TreS活性中心4?范圍左右的氨基酸；b-Lys 490空間位置及形成的氫鍵圖2 TreS分子對接結果分析Fig.2 Analysis of TreS Molecular Docking Results

通過分析來源于PseudomonasputidaS1、Pseudomonasmonteilii、Pseudarthrobactersiccitolerans等的海藻糖合酶氨基酸序列比對結果(圖3)，發(fā)現(xiàn)K490位點并非高度保守，不同來源的海藻糖合酶基因在此位置表現(xiàn)出差異。綜合以上結果，認為K490位點的突變可能會對TreS的催化中心產生一定的影響，對其催化能力帶來一定的提高，故選擇該位點進行飽和突變，篩選高轉化率突變子。

圖3 不同來源的海藻糖合酶序列比對Fig.3 Alignment of the amino acid sequence of TreS from different microorganism

2.2 飽和突變庫的構建

利用突變引物以PET-15b-TreS質粒為模板，PCR成功對K490位點進行了飽和突變，PCR產物電泳結果顯示條帶大小約為7 750 bp，符合模板質粒大小(如圖4-a所示)。將經(jīng)過Dpn I酶切處理的片段轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞中，通過抗性篩選得到飽和突變體庫，利用PCR隨機驗證突變子TreS基因，電泳顯示符合目的條帶大小(如圖4-b所示)。

M-DNA分子量標準；a-泳道1，飽和突變PCR產物電泳圖；b-泳道1～5，突變子隨機驗證PCR電泳圖圖4 目的基因PCR產物電泳圖Fig.4 DNA electrophoresis of PCR product

2.3 突變子的篩選

按照1.3、1.4所述方法進行突變庫的篩選，經(jīng)過HPLC檢測得到兩株海藻糖產量明顯提高的突變體，經(jīng)過基因測序及序列分析，發(fā)現(xiàn)突變位點由Lys(賴氨酸)分別變?yōu)長eu(亮氨酸)和Ile(異亮氨酸)。HPLC結果計算得到，原始酶轉率為50%，突變酶K490L轉化率為68%，K490I轉化率為65%，分別比原始酶提升了18%和15%(如圖5所示)。

圖5 原始酶及突變酶的轉化率Fig.5 Conversion rate of primitie enzyme and mutant enzyme

2.4 突變酶的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性

突變酶及原始酶的最適反應溫度如圖6-a所示，突變酶K490L,K490I的最適反應溫度與原始酶一致，為25 ℃，這說明突變氨基酸的引入并不會改變催化反應的最適溫度。原始酶在40 ℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性，而K490L,K490I在45 ℃保溫1 h后，剩余酶活力仍能保持在80%以上，相比原始酶得到大幅度的提高，在超過50 ℃時酶活迅速下降(圖6-b)。

圖6 突變酶的最適反應溫度(a)及熱穩(wěn)定性(b)Fig.6 The optimum reaction temperature (a) and thermal stability (b) of mutant enzyme

2.5 突變酶的最適反應pH及pH穩(wěn)定性

原始酶和突變酶的最適反應pH如圖7-a所示，突變酶K490L,K490I的最適反應pH沒有發(fā)生遷移，在pH8.0時表現(xiàn)出最大酶活力。原始酶在pH 7.5～9.0之間時保持較高酶活，而突變酶K490L,K490I在pH 7.0保溫1 h時仍保持80%以上酶活力，當pH低于7.0時，酶活迅速降低，在較低的pH條件下，酶活直接喪失(如圖7-b)。

2.6 突變位點的分析

亮氨酸和異亮氨酸都是非極性的疏水性氨基酸，二者的化學性質極為相似。通過PyMOL軟件分析突變后的TreS活性中心發(fā)現(xiàn)，490位氨基酸由Lys(圖8a)突變?yōu)長eu(圖8b)和Ile(圖8c)后，氨基酸性質發(fā)生了改變，活性中心的疏水作用得到增強，對于提高底物結合能力和催化反應具有一定的幫助。Leu和Ile較Lys疏水性增強，提高了該位點附近的結構穩(wěn)定性[23]，使形成的結合口袋更加緊密，對轉化過程中形成的葡萄糖分子形成了有效的空間位阻，進而促進產物海藻糖的形成，提高了反應的轉化率。490位點位于α螺旋末端，在α螺旋引入強疏水性氨基酸，對海藻糖合酶的穩(wěn)定性和底物結合能力都有重要的影響，疏水作用的增強也會增加蛋白的穩(wěn)定性[24]，因此K490L和K490I的熱穩(wěn)定性也有所提高。張悅等人對嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)海藻糖合酶α螺旋末端的Pro突變?yōu)長eu后，延長了螺旋結構提高了結構穩(wěn)定性，該酶的轉化率得到提升[25]。

圖7 突變酶的最適反應pH (a)及pH穩(wěn)定性(b)Fig.7 The optimum reaction pH (a) and pH stability(b) of mutant enzymes

a-Lys; b-Leu; c-Ile圖8 突變位點的模擬分析Fig.8 Simulation analysis of mutation sites

3 結論

本研究對來源于PseudomonasputidaP06的海藻糖合酶進行了蛋白質水平的改造，通過對Lys490位點的飽和突變，利用HPLC篩選得到了2株轉化率提高的突變體K490L和K490I，兩株突變體的轉化率分別為68%和65%，比原始酶提升了18%和15%。酶學性質研究發(fā)現(xiàn)，K490L和K490I的熱穩(wěn)定性(20～45 ℃)和耐酸性(pH 7.0～9.0)比原始酶顯著增強。通過PyMOL模擬了突變位點的改變，分析了K490L和K490I轉化率提高的原因。該研究表明，Lys490位點的分子改造能夠顯著提高TreS的轉化率，且改造后TreS酶學性質實用性增強，為以后海藻糖合酶的進一步改造奠定了理論基礎。

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