光動力抗微生物化學(xué)療法對解脲脲原體體外活性的影響

葉庭路，陳辦成，于波，楊虹，姜彬，邵勇，黃國新

1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚科，深圳 518036；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院檢驗科，深圳 518036；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，汕頭 515041

解脲脲原體(Ureaplasmaurealyticum，U.urealyticum)是一種重要的病原微生物。近年來，其耐藥形勢十分嚴峻，尤其是對喹諾酮類及大環(huán)內(nèi)酯類[1-2]耐藥。從懷孕患者中分離的解脲脲原體及合并人型支原體(Mycoplasmahominis)感染的解脲脲原體耐藥形勢更嚴重[3]。其耐藥主要與抗生素的不合理應(yīng)用有關(guān)，這種情況如果得不到有效遏制，耐藥形勢必將更嚴峻。因此，尋找一種全新的有效替代治療方案尤為重要。

光動力抗微生物化學(xué)療法(photodynamic antimicrobial chemotherapy，PACT)是一種以光敏劑、光及氧分子相互作用為基礎(chǔ)的新型抗感染方法。文獻報道 PACT對病毒、細菌、真菌及寄生蟲有抑制或滅活作用，但對解脲脲原體的體外活性是否有影響目前尚不清楚。本研究擬探討以甲苯胺藍(toluidine blue)為光敏劑的PACT對解脲脲原體的體外滅活作用，為其新型治療方法的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對象Uu-1(ATCC 27813，屬Parvo生物群)和Uu-5(ATCC 27817，屬T960生物群)兩種標準菌株由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科轉(zhuǎn)贈。解脲脲原體臨床株于2014年8月收集于北京大學(xué)深圳醫(yī)院皮膚性病科門診，菌株1(Uu-c1)經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)分群確定為Parvo生物群，菌株2(Uu-c2)經(jīng)PCR分群確定為T960生物群，均來自臨床表現(xiàn)典型的男性尿道炎患者尿道拭子標本。

1.1.2主要試劑與設(shè)備解脲脲原體液體培養(yǎng)基購于珠海麗珠試劑股份有限公司，固體鑒定培養(yǎng)基購于廣州市怡林園生物工程有限公司。甲苯胺藍購于美國Sigma公司，以去離子水配制成25 mmol/L的儲存液，實驗前用支原體液體培養(yǎng)基稀釋成 5 mmol/L 的工作液。DNA分群鑒定引物為：上游5′-GTATTTGCAATCTTTATATGTTTTCG-3′，下游5′-CAGCTGATGTAAGTGCAGCATTAAAT-TC-3′，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)試劑盒及DNA marker購自天根生化科技(北京)有限公司，瓊脂糖購自廣州威佳科技有限公司。光源為武漢亞格光電技術(shù)有限公司的LED-IB光動力治療儀，波長(633±10)nm，最大功率密度100 mW/cm2。LRH-70F生化培養(yǎng)箱購于上海一恒科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1解脲脲原體的純化、鑒定及密度測定解脲脲原體臨床株收集后，培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基，24 h內(nèi)待培養(yǎng)基顏色由黃色轉(zhuǎn)為淡紅色(仍保持澄清，不渾濁)，轉(zhuǎn)種于固體鑒定培養(yǎng)基純化，待出現(xiàn)典型棕黑色海膽狀細小菌落，挑取單個典型菌落轉(zhuǎn)種于液體培養(yǎng)基增菌，以保證菌株的純度。另取一份標本行PCR鑒定及分群，具體操作參照本課題組以前的報道[4-5]。解脲脲原體臨床株及標準株均采用顏色改變單位(color change unit，CCU)法測定菌液密度，于96孔聚苯乙烯酶標板進行，具體操作見參考文獻[6]。將菌液增菌或稀釋至CCU為104～105，于-70 ℃保存以備用。

1.2.2解脲脲原體與光敏劑孵育菌株的孵育于96孔聚苯乙烯酶標板(12行標記為1～12，8列標記為A～H，詳見圖1)中進行。首先將液體培養(yǎng)基加入預(yù)先準備好的96孔酶標板第1、3、5、7、10行的第1～8孔，每孔90 μL。從第2孔起，每孔加入90 μL 5 mmol/L 甲苯胺藍工作液，充分均勻后吸取90 μL至第3孔，均勻后再從第3孔吸取90 μL至第4孔，如此進行倍比稀釋，依次形成2.5～0.039 062 5 mmol/L的甲苯胺藍溶液。每行第1孔(A列)不加任何光敏劑，作為光敏劑空白對照。將保存的密度為104～105的解脲脲原體菌液復(fù)蘇，于第1、3、5、7行每孔分別加入菌株Uu-1、Uu-5、Uu-c1、Uu-c2各10 μL。第10行光照前不加菌株，光照后再加入菌株作為非光照對照組(見下述)。蓋好酶標板蓋后，置于37 ℃生化箱中避光孵育。按孵育時間分兩組，分別為30、60 min(圖1)。每株菌株均操作3個96孔聚苯乙烯酶標板，取均值。

圖1實驗操作示意圖
Fig.1Diagramofexperimentoperation

1.2.3光照孵育后，將酶標板置于黑房中進行光照。光源波長633 nm，能量功率密度均為100 mW/cm2，照射時間分別為8、17、34和68 min，故總能量密度分別為48、102、204和408 mJ/cm2。保證光源垂直照射，光源距離酶標板20 cm。

1.2.4再培養(yǎng)光照后，在原酶標板第2、4、6、8行每孔分別加入解脲脲原體液體培養(yǎng)基90 μL。將第1、3、5、7行每孔內(nèi)解脲脲原體菌液各吸取10 μL，分別轉(zhuǎn)種至第2、4、6、8行對應(yīng)孔內(nèi)。第10行每孔在光照后加入10 μL解脲脲原體菌株(Uu-1、Uu-5、Uu-c1或Uu-c2，每張酶標板只加1種)。加樣完成后，每孔均滴加1滴無菌石蠟油覆蓋以避免培養(yǎng)基揮發(fā)。第10行菌株孵育20 min或60 min后，按上述方法轉(zhuǎn)種于第11行(圖1)。另在第12行加入與第2、4、6、8行內(nèi)含相同濃度甲苯胺藍的支原體培養(yǎng)基，作為判讀結(jié)果的標準顏色參照。接種完成后，將酶標板置于生化培養(yǎng)箱同樣環(huán)境中進行再培養(yǎng)。

1.2.5結(jié)果判讀孵育48 h后觀察并判讀結(jié)果。相對于第12行的標準顏色參照，孔內(nèi)液體顏色明顯變深，提示解脲脲原體生長，判讀為解脲脲原體陽性(圖2)。

圖2結(jié)果示意圖
Fig.2Diagramofexperimentresults

2 結(jié)果

2.1 PACT中甲苯胺藍濃度對解脲脲原體活性的影響

每塊酶標板第10、11孔的對照組顯示，接種的Uu-1、Uu-5、Uu-c1或Uu-c2菌株在每孔中均能良好生長。但與不加光敏劑的A列相比，甲苯胺藍≥0.312 5 mmol/L的孔較更低濃度或不加甲苯胺藍的孔出現(xiàn)顏色變化要晚6～12 h。在光照能量密度及解脲脲原體與甲苯胺藍孵育時間固定的前提下，PACT對解脲脲原體的滅活作用隨甲苯胺藍濃度的增加而增強，即呈甲苯胺藍濃度依賴的模式(表1)。

2.2 PACT中光照能量密度對解脲脲原體活性的影響

在無光敏劑時，以不同能量照射解脲脲原體，4種能量密度下所有菌株均能生長，且生長速度與非光照且不加甲苯胺藍的解脲脲原體相當(dāng)，提示本研究所用的633 nm紅光光源在408 J/cm2及以下的能量密度對解脲脲原體的活性無明顯影響。在甲苯胺藍濃度及其與解脲脲原體孵育時間固定的條件下，PACT對解脲脲原體的滅活作用隨光照能量密度的增加而增強，即呈光照能量密度依賴的模式(表1)。

表1PACT處理后解脲脲原體仍可生長的甲苯胺藍最高濃度
Tab.1ThemaximumtoluidineblueconcentrationofU.urealyticumsurvivalafterPACTtreatment(mmol/L)

StainIncubationtime(min)Iradiationfluence(J/cm2)048102204408Uu?130≥2．5≥2．51．250．31250．039062560≥2．5≥2．50．6250．15625<0．0390625Uu?530≥2．5≥2．5≥2．50．31250．1562560≥2．51．251．250．156250．078125Uu?c130≥2．5≥2．51．250．156250．1562560≥2．5≥2．50．6250．156250．078125Uu?c230≥2．5≥2．51．250．156250．1562560≥2．5≥2．50．6250．0781250．078125

2.3 PACT中光敏劑孵育時間對解脲脲原體活性的影響

本研究采用兩個光敏劑孵育時間，以比較孵育時間對PACT作用的影響。由表1可見，總的趨勢是隨光敏劑孵育時間延長，PACT對解脲脲原體的滅活作用有增強趨勢。

2.4 不同解脲脲原體生物群對PACT敏感性的差異

選用兩種解脲脲原體生物群各兩株菌株(包括標準株及臨床分離株)，由表1可見，兩種生物群之間標準株與臨床株對PACT的敏感性相似。

3 討論

病原微生物耐藥的廣泛蔓延促進了大量抗微生物感染的研究，但至今缺乏安全、有效的治療方法。PACT是一種結(jié)合光敏劑分子和可見光照射產(chǎn)生活性中間產(chǎn)物，對病原微生物進行滅活的抗微生物方法。近年來，隨著光敏劑及激光技術(shù)的發(fā)展，PACT抗耐藥微生物感染的治療研究得到廣泛關(guān)注。體外和動物研究表明，PACT已成功用于革蘭陽性及革蘭陰性菌[7-8]、病毒[9]、真菌[10]、寄生蟲[11-12]感染的治療，至今尚無文獻報道微生物對PACT治療的耐受性。因此，PACT有望成為微生物感染領(lǐng)域中頗有前景的替代治療方法。

目前尚無PACT對解脲脲原體活性影響的報道，本研究首次嘗試在體外探討甲苯胺藍介導(dǎo)的PACT對解脲脲原體的滅活作用。甲苯胺藍是一種常用的PACT光敏劑，較常應(yīng)用于PACT的研究。甲苯胺藍在常規(guī)劑量下對細菌等無明顯滅活作用，但在合適光源存在時能有效抑制革蘭陽性及革蘭陰性細菌生長[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，甲苯胺藍在2.5 mmol/L時對解脲脲原體生長有一定抑制，但無完全滅活作用。在有光照時，PACT對解脲脲原體的滅活作用呈甲苯胺藍濃度依賴模式。同樣，633 nm紅光光源在408 J/cm2及以下能量密度時對解脲脲原體生長活性基本無影響，但在甲苯胺藍存在時對解脲脲原體的滅活作用呈光照能量密度依賴模式。此外，延長解脲脲原體與甲苯胺藍孵育時間在一定程度上也增強了PACT對解脲脲原體的滅活效果，與PACT對白假絲酵母(又稱白念珠菌)的效果類似[14]，提示PACT有望成為解脲脲原體感染的有效替代治療方法。但PACT對耐藥解脲脲原體是否也具有滅活作用，或是否能增加耐藥解脲脲原體對藥物的敏感性，需進一步深入研究。

PACT殺滅解脲脲原體的機制尚不清楚。Rosseti等[14]研究發(fā)現(xiàn)，甲苯胺藍介導(dǎo)的PACT對白念珠菌生物膜的形成有顯著抑制作用，且這種作用與真菌細胞在光照后于培養(yǎng)基中的孵育時間有關(guān)，時間越長則抑制效果越明顯。機制研究發(fā)現(xiàn)，這種作用與PACT增加真菌細胞壁通透性及培養(yǎng)基內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)有關(guān)。與此類似，PACT對革蘭陽性及革蘭陰性細菌的殺滅作用有賴于三線態(tài)光子和ROS的產(chǎn)生，通過Ⅰ型機制及Ⅱ型機制殺滅病原體[15]。形態(tài)學(xué)上，解脲脲原體沒有細胞壁，只有一種3層結(jié)構(gòu)的單位膜，更接近革蘭陰性細菌。甲苯胺藍介導(dǎo)的PACT也可能通過類似作用滅活解脲脲原體，但具體機制有待進一步研究證實。

解脲脲原體有兩種生物群，兩群之間致病性可能存在差異[16-17]。本研究使用解脲脲原體兩種生物群的臨床株及標準株，探討它們對PACT反應(yīng)性的差異。初步結(jié)果顯示，解脲脲原體兩種生物群對PACT的反應(yīng)性相似，但滅活作用是否存在差異需更大樣本研究。

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