滅幼脲對粘蟲圍食膜的影響及與其病毒的聯(lián)合毒力作用

田曉麗， 盧文濤

(1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北 荊州 434025)

【研究意義】粘蟲Mythimnaseparata(Walker) 屬鱗翅目，夜蛾科，是我國重要的糧食作物害蟲，嚴(yán)重為害麥類、玉米、谷子、高粱、水稻等多種禾本科作物。同時，粘蟲為典型的遷飛性害蟲，每年會在我國南北方往返遷飛為害，屬于“R對策”害蟲。這類害蟲往往會在其遷入地突然暴發(fā)成災(zāi)，需要及時防治，否則損失嚴(yán)重，甚至絕收。因此，速效性的化學(xué)農(nóng)藥是防治這種突發(fā)蟲害的重要手段。然而，大量化學(xué)農(nóng)藥的使用必然會出現(xiàn)“3R問題”。目前，提高無公害生物防治的速效性是解決問題的有效途徑之一?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】核型多角體病毒 (Pseudaletia Nuclear Polyhedrosis Virus，PsNVP) 是粘蟲的重要病原微生物殺蟲劑[1]。但是，實際田間防治效果不夠理想，尤其對于需要迅速防治的“R對策”類害蟲，存在毒力較低，殺蟲效果表現(xiàn)緩慢的缺點，使其大田應(yīng)用受到限制。因此，許多研究者尋找有效的增效劑以提高核型多角體病毒的速效性[2-5]。而衡量一個增效劑的優(yōu)劣在很大程度上取決于它對昆蟲圍食膜的破壞效果。圍食膜(Peritrophic membrane)是昆蟲中腸內(nèi)的一層非細(xì)胞薄膜狀結(jié)構(gòu)，位于食物和中腸上皮細(xì)胞之間，由中腸前端一直延伸至后腸，呈長筒狀[6]。圍食膜的主要功能之一是作為中腸上皮細(xì)胞和食物之間的有效屏障，防止昆蟲攝取的粗糙食物對中腸上皮細(xì)胞的機(jī)械損傷，以及有效預(yù)防病毒、細(xì)菌等病原體對蟲體的入侵。如果圍食膜遭到破壞就會喪失其屏障功能，有利于病原生物的感染[7]。利用化合物對圍食膜的破壞作用篩選增效劑已有部分研究，朱蓉等[3]研究了光增白劑對甜菜夜蛾圍食膜結(jié)構(gòu)的作用與影響；張小霞等[2]探究了剛果紅對棉鈴蟲中腸圍食膜的影響及其病毒增效作用；李怡萍等[5]研究了熒光增白劑對Cry1Ac抗感棉鈴蟲圍食膜的影響及增效作用；呂敏等[4]探討了天然產(chǎn)物梣酮對粘蟲圍食膜的影響?！颈狙芯壳腥朦c】滅幼脲是一種昆蟲生長發(fā)育調(diào)節(jié)劑，主要作用是抑制幾丁質(zhì)合成，從而使富含幾丁質(zhì)的表皮合成異常，蛻皮困難，以達(dá)到防蟲的目的。昆蟲圍食膜同樣含有幾丁質(zhì)，滅幼脲是否可以作為粘蟲核型多角體病毒的增效劑，破壞圍食膜的結(jié)構(gòu)，提高這種病毒殺蟲的速效性，值得研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】本文旨在明確滅幼脲對粘蟲中腸圍食膜的破壞作用以及對粘蟲核型多角體病毒增效作用，為開發(fā)高效，實用、環(huán)境友好型的微生物殺蟲劑提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試蟲和藥劑

粘蟲幼蟲采自湖北省荊州市荊州區(qū)麥田；2.5×1011PIB/g粘蟲核多角體病毒由中科院動物研究所農(nóng)業(yè)蟲鼠害綜合治理研究國家重點實驗室提供，準(zhǔn)確稱取1 g PsNVP、93 g滑石粉和6 g洗衣粉之后將各組分放入研缽中充分研磨混勻并過篩使其濃度調(diào)整為2.5×109PIB/g，然后制成20 %(質(zhì)量體積比)的母液。20 %滅幼脲懸浮劑由吉林省通化農(nóng)藥化工股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 正常圍食膜電鏡觀察

將粘蟲幼蟲置于冰盤上剖取圍食膜，用緩沖液漂洗剖取的圍食膜至無色透明，無粘附物。放入盛有戊二醛固定液的青霉素小瓶中過夜，次日用磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min。然后用30 %、50 %、75 %、80 %、90 %、95 %丙酮脫水，各1次，每次10 min；100 %的酒精脫水2次，每次20 min。乙酸異戊酯置換2次，每次20 min。CO2臨界點干燥后在真空噴鍍儀內(nèi)噴鍍10～20 nm的金屬膜，最后置于電子顯微鏡下觀察圍食膜表面形態(tài)結(jié)構(gòu)并照相。

1.3 滅幼脲處理圍食膜電鏡觀察

選取經(jīng)饑餓24 h的粘蟲6齡幼蟲數(shù)頭，飼喂以在20 %滅幼脲懸浮劑1000倍液中浸泡10 s并晾干的的小麥葉片，分別于粘蟲幼蟲取食36、72和96 h后將試蟲放在冰盤上剖取圍食膜進(jìn)行電鏡觀察。(圍食膜制樣過程同上)。

1.4 滅幼脲與PsNVP聯(lián)合毒力作用試蟲處理

1.4.1 2個單劑毒力的測定 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)上，將供試藥劑用蒸餾水配成5～6濃度(1、6齡粘蟲幼蟲滅幼脲設(shè)133.33、100.00、80.00、66.67和 57.14 mg/L 5個濃度梯度，PsNVP設(shè)20.00、15.38、12.50、10.53和9.09 mg/L 5個濃度梯度；3、4、5齡粘蟲幼蟲 滅幼脲設(shè)400.00、200.00、 133.33、 100.00和80.00 mg/L 5個濃度梯度，PsNVP設(shè)20.00、15.38、12.50、10.53和9.09 mg/L 5個濃度梯度)，設(shè)清水為對照。將小麥片剪成長4 cm，寬1 cm的葉條，分別在各濃度藥液中浸泡10 s，取出晾干，置于墊有濾紙的培養(yǎng)皿中(直徑9 cm),每皿10片葉條，按不同蟲齡接入粘蟲幼蟲10頭，每個處理重復(fù)30次，實驗3次。試驗期間每天定時觀察幼蟲發(fā)育及存活情況。計算死亡率，校正死亡率。將粘蟲的平均校正死亡率換算成機(jī)率值(y)，處理濃度(mg/L) 轉(zhuǎn)換成對數(shù)值(x)， 根據(jù)濃度對數(shù)—死亡率機(jī)率值分析(Bliss)法[8]。求出毒力回歸方程和致死中濃度LC50的值。

1.4.2 增效作用的測定 預(yù)先測定滅幼脲和SeMNPV不同配比復(fù)合物有效致死濃度范圍后，滅幼脲和SeMNPV按1∶8；1∶9；1∶10；1∶12；1∶14比例混配，每個配比的藥液按上述方法進(jìn)行毒力測定5個配比的混劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，根據(jù)孫云沛Sun-Johnson方法，計算各混劑的共毒系數(shù)(Co-toxicity Coefficient CTC)[9]。然后根據(jù)CTC決定最佳配比。若混劑的共毒系數(shù)接近100，表示此混劑的作用是相加作用；若共毒系數(shù)顯著>100，表示有增效作用；若共毒系數(shù)<100，則表示有拮抗作用。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

實測混劑的毒力指數(shù)(ATI)=

理論混劑的毒力指數(shù)(ATI)=A毒力的指數(shù)×A在混劑中占的百分率+B毒力的指數(shù)×B在混劑中占的百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 滅幼脲處理對圍食膜外部形態(tài)的影響

解剖實驗發(fā)現(xiàn)，健康粘蟲幼蟲圍食膜富有彈性，呈無色透明管狀結(jié)構(gòu)，包裹著食物。掃描電鏡觀察表明，健康粘蟲幼蟲圍食膜表面光滑，結(jié)構(gòu)致密有序，除有一些細(xì)小的皺褶外，沒有間隙，這種結(jié)構(gòu)和形態(tài)保證了圍食膜對昆蟲中腸的防護(hù)功能(圖1-A)。解剖實驗發(fā)現(xiàn)，滅幼脲處理后的粘蟲幼蟲圍食膜出現(xiàn)明顯病變(圖1-E)。滅幼脲對粘蟲幼蟲處理36、72、96 h的圍食膜電子掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：滅幼脲處理36 h后，圍食膜表面結(jié)構(gòu)明顯變的粗糙，易出現(xiàn)一些凹溝和細(xì)縫(圖1-B箭頭示)。滅幼脲處理后72和96 h，圍食膜已經(jīng)明顯變薄，顏色逐漸加深，凹溝和細(xì)縫進(jìn)一步增大，并隨著時間的延長有加重的趨勢(圖1-C和D)。

2.2 滅幼脲與PsNVP單劑及聯(lián)合毒力作用

2.2.1 滅幼脲和PsNVP單劑對粘蟲幼蟲的毒力作用 表1顯示：滅幼脲與PsNVP對粘蟲2齡幼蟲的LC50分別是72.44和12.02 mg/L；滅幼脲與PsNVP對粘蟲6齡幼蟲的LC50分別是123.03和12.58 mg/L；滅幼脲與PsNVP對粘蟲3齡幼蟲的LC50分別是223.87和17.78 mg/L；滅幼脲與PsNVP對粘蟲4齡幼蟲的LC50分別是263.02和19.05 mg/L；滅幼脲與PsNVP對粘蟲5齡幼蟲的LC50分別是245.47和15.85 mg/L。從半致死濃度LC50可以發(fā)現(xiàn)，2齡幼蟲和6齡幼蟲的LC50明顯低于3、4、5齡幼蟲，說明2、6齡幼蟲對這兩種藥劑的敏感性高于3、4、5齡幼蟲。

A.正常圍食膜電鏡照片；B．滅幼脲飼喂36 h后的圍食膜電鏡照片；C．滅幼脲飼喂72 h后的圍食膜電鏡照片；D．滅幼脲飼喂96 h后的圍食膜電鏡照片；E. 滅幼脲飼喂96 h后的試蟲圍食膜照片A. SEM photo of the peritrophic membrane of M. separate; B．SEM photo of the peritrophic membrane of M. separata reared with 20 % Diflubenzuron after 36 hours; C．SEM photo of the peritrophic membrane of M. separata reared with 20 % Diflubenzuron after 72 hours; D. SEM photo of the peritrophic membrane of M. separata reared with 20 % Diflubenzuron after 96 hours; E. Photo of the peritrophic membrane of M. separata reared with 20 % Diflubenzuron after 96 hours圖1 粘蟲6齡幼蟲的圍食膜電鏡照片F(xiàn)ig.1 The peritrophic membrane of the 6th instar larva of M.separata

表1 滅幼脲和PsNVP單劑對粘蟲幼蟲的毒力

注：A——滅幼脲；B——粘蟲核多角體病毒。

表2 滅幼脲與PsNVP混配對粘蟲幼蟲的聯(lián)合毒力

注：A——滅幼脲；B——粘蟲核多角體病毒。

2.2.2 滅幼脲和PsNVP混配對粘蟲幼蟲的毒力作用 從表2可以看出，滅幼脲與PsNVP混合對粘蟲各齡幼蟲均表現(xiàn)出不同程度的增效作用。其中對4齡幼蟲在混配比例1∶9的時候，增效作用最明顯，共毒素數(shù)達(dá)353，顯著提高了殺蟲的速度和效果，這對于彌補滅幼脲類殺蟲劑對高齡幼蟲藥效低和病毒制劑殺蟲時間長的缺點具有一定參考作用。同時試驗發(fā)現(xiàn)，兩者混用對3和5齡幼蟲的增效作用也較好，共毒系數(shù)分別為302和304，再次是對2和6齡幼蟲，共毒系數(shù)分別為125和209。

3 討 論

圍食膜是昆蟲中腸內(nèi)的一層非細(xì)胞薄膜狀結(jié)構(gòu)，由粘多糖、蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)構(gòu)成，是昆蟲抵御隨食物攝取的有害微生物入侵的第一道屏障。因此，通常作為研究病原微生物入侵蟲體的潛在靶標(biāo)[10-11]。滅幼脲殺蟲劑是一類幾丁質(zhì)合成抑制劑。這類昆蟲生長調(diào)節(jié)類殺蟲劑可以減低O-糖苷鍵對圍食膜的保護(hù)，阻止其幾丁質(zhì)的合成[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，健康粘蟲圍食膜富有彈性，表面光滑，沒有間隙；而滅幼脲處理后的圍食膜明顯變薄，表面較粗糙，易出現(xiàn)細(xì)小裂隙，并隨處理時間的延長有加重的趨勢。這可能與滅幼脲抑制了圍食膜幾丁質(zhì)的合成有關(guān)[12-13]。據(jù)此推斷，PsNVP+滅幼脲混劑的滅幼脲進(jìn)入昆蟲中腸后應(yīng)該能夠降低圍食膜的厚度，促進(jìn)PsNVP的入侵，提高PsNVP的毒力。本研究中，對3～5齡粘蟲幼蟲的生測結(jié)果驗證了這一推斷，即 滅幼脲對PsNVP具有明顯增效作用。但是對于2、6齡幼蟲，該混劑并沒有表現(xiàn)出明顯的增效作用。根據(jù)表1的LC50值，認(rèn)為這是由于藥劑對2、6齡幼蟲的毒力明顯高于3～5齡幼蟲所致，換言之，2和6齡幼蟲對藥劑具有較高敏感性。其中，2齡幼蟲對藥劑的高敏感性可能是由于體內(nèi)解毒酶活性比較低，對殺蟲劑的解毒代謝能力弱。但對6齡幼蟲原因可能來自兩個方面，一方面，6齡幼蟲取食能力逐漸減弱，代謝機(jī)能降低，體內(nèi)解毒酶的活性下降，從而對藥劑的抗性逐漸減弱[11, 14]。另一方面，末齡幼蟲即將化蛹，而不再大量取食，使得圍食膜的合成受到影響，從而削弱了其屏障的功能，促進(jìn)了病毒的入侵[2]。

篩選昆蟲病毒的有效增效劑是解決病毒類殺蟲劑作用速度效果緩慢，殺蟲譜窄和活性低等問題的重要途徑之一。一方面，可明顯提高這類生物殺蟲的速效性，減少用量、降低成本；另一方面，也能有效緩和大量使用化學(xué)藥劑所帶來的“3R問題”。目前，在實際生產(chǎn)中也普遍存在其他藥劑與昆蟲病毒混合使用的現(xiàn)象，但是大多以化學(xué)藥劑為主要成分。由于這種不合適的藥劑和配比，使得昆蟲病毒還未發(fā)揮功效，害蟲已經(jīng)神經(jīng)中毒死亡，這本質(zhì)上還是化學(xué)殺蟲劑的單獨作用[15]。這樣的混劑不但起不到預(yù)想效果，反而浪費了昆蟲病毒加重了害蟲的抗藥性。本實驗將昆蟲病毒PsNVP與滅幼脲混用，既保持了生物農(nóng)藥的速效性，又保證了對抗性害蟲的特異性，并且對人畜無害，不造成環(huán)境污染。這對于拓寬害蟲生物綜合防治具有一定意義。

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