貴州修文獼猴桃根結線蟲的發(fā)生種類與鑒定

陳 文，孫燕芳，吳石平，李添群，唐靖文，龍海波*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院 植物保護研究所，貴州 貴陽 550006；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院 環(huán)境與植物保護研究所，海南 海口 571101；3.貴州省修文縣植保植檢站，貴州 修文 550200；4.貴州省修文縣獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展局，貴州 修文 550200)

【研究意義】獼猴桃根結線蟲病是獼猴桃生產(chǎn)上重要病害之一，常造成獼猴桃植株的根部腫大呈瘤狀或根結狀，后期瘤狀物和病根腐爛，地上部表現(xiàn)整株萎蔫死亡，影響樹勢生長，嚴重降低獼猴桃產(chǎn)量及品質(zhì)?！厩叭搜芯窟M展】在我國陜西、福建、湖南和貴州等地均有危害報道，主要為南方、花生、爪哇和北方根結線蟲等種類，其發(fā)病率在10 %～100 %[1-5]。修文縣是貴州獼猴桃主產(chǎn)區(qū)，截止2014年全縣獼猴桃種植面積為9000 hm2，受根結線蟲危害面積20 hm2[5]，近年來獼猴桃種植面積逐年增加，很多新建果園及苗圃都受到根結線蟲危害。由于根結線蟲不同種類對作物危害特性不同，開展根結線蟲鑒定，對于抗病育種、植物檢疫、掌握病原線蟲的生活習性及防治等具有重要指導作用?！颈狙芯壳腥朦c】鑒于貴州獼猴桃根結線蟲危害重且種類未見詳細報道。【擬解決的關鍵問題】于2016年2月至2017年4月調(diào)查貴州修文縣獼猴桃主產(chǎn)區(qū)根結線蟲的發(fā)生危害情況，采用會陰花紋形態(tài)特征[6]及結合PCR技術[7-12]鑒定根結線蟲種類，為該獼猴桃根結線蟲的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

在根結線蟲發(fā)生危害的獼猴桃產(chǎn)區(qū)，采集根結線蟲病根，在顯微鏡下用挑針和毛筆從病根組織中直接分離雌成蟲置于含去離子水的凹形皿中，備用。

1.2 根結線蟲的調(diào)查

2016-2017年調(diào)查貴州修文縣獼猴桃產(chǎn)區(qū)的折溪村、高寨村、上洞村、平攤村、中哨村、綠水村和下洞村等地12個果園和3個苗圃根結線蟲發(fā)生情況。采用5點取樣法對每一果園獼猴桃根部進行取樣，挖取表土取獼猴桃須根，每個果園取10～12株，苗圃調(diào)查數(shù)量視面積及農(nóng)事操作不同。采集根結線蟲病根，標注信息，帶回實驗室分離根結線蟲。

1.3 根結線蟲的形態(tài)觀察

參照張紹升的方法[13]并改進制作根結線蟲雌成蟲會陰花紋，在顯微鏡下觀察。

1.4 rDNA-ITS區(qū)序列擴增

在各個村隨機挑取4個雌成蟲標樣，共20個標樣，分別置于10 μl滅菌雙蒸水的PCR管中，編號見表1。提取DNA參照萬新龍的方法改進[14]。對PCR管中線蟲點動離心后放入-20 ℃冷凍3 min，利用10 μl小槍頭研磨固體，加入7 μl 10×PCR Buffer，3 μl蛋白酶K(20 mg/mL)點動離心，置于-20 ℃冷凍90 min，后取出輕彈混勻后PCR 儀中65 ℃溫育90 min，接著95 ℃保溫 10 min。樣品于12 000 r/min 離心1 min，取其上清液用于PCR 擴增或于-20 ℃保存?zhèn)溆谩＠肰rain設計的線蟲通用引物V5367/26S(TTGATTACGTCCCTGCCCTTT/TTTC ACTCGCCGTTACTAAGG)擴增ITS區(qū)，退火溫度55 ℃，35次循環(huán)[9]，對單個線蟲DNA進行PCR擴增。

1.5 特異性序列擴增

每個地點隨機選取1個ITS區(qū)擴增陽性樣品，共5個樣品進行特異性片段擴增分析。

選擇南方、花生和爪哇根結線蟲的特異性引物，Meng等[11]設計的南方根結線蟲特異性標記MIF/MIR(GTGAGGATTCAGCTCCCCAG/ACGAGGAACA TACTTCTCCGTCC)，退火溫度62 ℃，目標條帶955 bp，Zijlstra等[12]設計的花生根結線蟲特異性標記Far/Rar(TCGGCGATAGAGGTAAATGAC/TCGGCGA TAGACACTACAACT)，退火溫度61 ℃，目標條帶420 bp及爪哇根結線蟲特異性標記Fjav/Rjav(GGTGCGCGATTGAACTGAGC/CAGGCCCTTCAGTGGAACTATAC)，退火溫度64 ℃，目標條帶670 bp，對單個線蟲DNA進行PCR擴增。

1.6 PCR產(chǎn)物的回收

PCR產(chǎn)物采用1.8 %的瓊脂糖凝膠110 V電泳30 min，用1× TAE作為電泳緩沖液，并在紫外燈下觀測照相。PCR產(chǎn)物采用TIANGEN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒進行回收純化，具體操作步驟參照試劑盒操作說明。

1.7 PCR產(chǎn)物的克隆及序列測定

表1 供試根結線蟲編號及來源

表2 根結線蟲在貴州修文不同地區(qū)的發(fā)生程度

將純化后的PCR產(chǎn)物與PGEM-T Easy Vector在4 ℃下連接12～16 h，采用熱擊法轉化到E.coliDH5a感受態(tài)細胞中。在含有Ampicillin(100 mg/L)，PTG(24 mg/L)和X-gal(200 mg/L)的LB篩選平板上挑取單個白色菌落于含有Ampicillin(100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中搖培過夜。用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)PCR鑒定后，篩選含有正確插入片段的重組克隆送諾賽基因有限公司進行序列測序。

1.8 序列分析

采用Lasergene軟件進行序列拼接，利用Bioedit軟件對測定的序列進行比對分析，利用paup4.0制作聚類樹。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃根結線蟲危害及發(fā)生

2016年2月至2017年4月調(diào)查修文獼猴桃產(chǎn)區(qū)根結線蟲情況發(fā)現(xiàn)，獼猴桃樹受害，樹勢弱，植株葉片小、發(fā)黃，根部須根出現(xiàn)根瘤狀，后期根瘤狀須根腐爛。由表2可見，在貴州修文縣折溪村、高寨村、上洞村、平攤村和中哨村等地的獼猴桃成年果園及苗圃均有根結線蟲發(fā)生，其中折溪村獼猴桃成年果園根結線蟲發(fā)生率最高，為80.00 %；高寨村發(fā)生率次之，為30.30 %；中哨村發(fā)生率最低，僅13.33 %。在綠水村繩橋苗圃及下洞村烏泥苗圃未見其發(fā)生。

2.2 根結線蟲的形態(tài)觀察

經(jīng)獼猴桃根結中的根結線蟲分離及雌成蟲會陰花紋圖1發(fā)現(xiàn)，分離到的根結線蟲雌成蟲會陰花紋有高而方的背弓，由平滑形線紋組成，線紋呈波浪狀，細到粗，清楚，有些線紋在側面分叉，無明顯側線。

2.3 根結線蟲的分子鑒定

利用通用引物V5367/26S對來自5個村的20個線蟲DNA標樣進行擴增表明，利用V5367/26S引物對20個標樣進行擴增(圖2)，有15個標樣表現(xiàn)陽性，獲得長度約為760 bp的電泳條帶。對來自5個不同地方的ITS區(qū)擴增陽性樣品進行測序及同源性比對分析，表明其均與南方、爪哇和花生根結線蟲的ITS序列一致性高達99 %～100 %；在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載南方、花生、爪哇和北方根結線蟲序列與5個標樣序列進行聚類分析表明5個樣品與南方、花生和爪哇根結線蟲的序列聚在1個分枝上且置信度為100，表明貴州修文獼猴桃根結線蟲可能為南方、花生或爪哇根結線蟲中的1種或幾種(圖3)。

圖1 根結線蟲雌蟲分離及會陰花紋觀察Fig.1 Separation of female root knot nematodes and its perineal pattern

M為MarkerD2000(下同)，1～20孔分別為Z1、Z2、Z3、Z4、G1、G2、G3、G4、S1、S2、S3、S4、Z1、Z2、Z3、Z4、ZS1、ZS2、ZS3、ZS4M,Marker D2000; 1-20, Z1,Z2, Z3, Z4,G1, G2,G3,G4,S1, S2, S3, S4, Z1, Z2, Z3, Z4, Z1, ZS2, Z3 and ZS4 respectively圖2 根結線蟲rDNA-ITS序列的PCR擴增圖譜Fig.2 PCR amplification pattern of rDNA-ITS sequence of root knot nematodes

圖3 基于根結線蟲ITS序列的聚類樹Fig.3 Clustering analysis based on ITS sequency of Meloidogyne incognita

1～5孔為Z2、G1、S1、Z1、ZS1，6～10孔為Z2、G1、S1、Z1、ZS11-5, Z2, G1, S1, Z1 and ZS1; 6-10, Z2,G1, S1, Z1 and ZS1 respectively圖4 PCR擴增根結線蟲rDNA-ITS序列及南方根結線蟲特異性序列Fig.4 rDNA-ITS sequence amplified by PCR and specific sequence of Meloidogyne incognita

利用南方、花生和爪哇根結線蟲特異性引物MIF/MIR，F(xiàn)ar/Rar和Fjav/Rjav對20個DNA標樣進行擴增，僅MIF/MIR引物獲得約955 bp的電泳條帶，選取上述5個不同地方的DNA樣品特異性片段(圖4)，進行膠回收、重組克隆及測序，經(jīng)過Blast N 同源性搜索比對顯示，5個標樣與 NCBI 數(shù)據(jù)庫中的南方根結線蟲的序列(登錄號：JN005841.1.1)相似度均為100 %。

3 討 論

范學科等[1]報道，陜西周至和戶縣的獼猴桃根結線蟲為南方根結線蟲；張紹升等[2]報道，福建建寧縣獼猴桃根結線蟲由爪哇和南方根結線蟲引起，爪哇根結線蟲為優(yōu)勢種；方言祖等[4]報道，湖南獼猴桃根結線蟲為南方和花生根結線蟲，南方根結線蟲為優(yōu)勢種；而貴州獼猴桃根結線蟲種類鑒定未見詳細報道。本研究通過根結線蟲的形態(tài)觀察結合分子生物學技術對貴州修文獼猴桃主產(chǎn)區(qū)根結線蟲進行鑒定，僅發(fā)現(xiàn)了南方根結線蟲，鑒于貴州修文近年來從湖南大量引進獼猴桃苗木，且報道湖南獼猴桃根結線蟲危害種類主要為南方和花生根結線蟲，在貴州果園不排除存在花生根結線蟲危害。同時由于采樣區(qū)域及標樣數(shù)量有限，可能存在其他危害種類，為準確掌握貴州修文獼猴桃根結線蟲群體分布，可擴大樣本采集區(qū)域以及標樣數(shù)量開展鑒定，也便于制定不同防治策略。

分子鑒定速度快、成本低、效率高等優(yōu)勢在根結線蟲快速鑒定中廣泛應用，萬新龍等[10]對根結線蟲ITS序列進行分析發(fā)現(xiàn)，我國農(nóng)作物和蔬菜上的根結線蟲主要由南方、北方、爪哇和花生根結線蟲引起。本研究利用ITS區(qū)鑒定的獼猴桃根結線蟲，通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，僅能將北方根結線蟲分開，而并不能將南方、爪哇和花生根結線蟲區(qū)分開來，為此選擇了南方、爪哇和花生根結線蟲特異性引物進行鑒定，在試驗中擴增ITS區(qū)及南方根結線蟲特異性片段時發(fā)現(xiàn)有4個標樣均表現(xiàn)為陰性，主要原因是單條雌成蟲DNA提取失敗造成。

4 結 論

通過根結線蟲會陰花紋形態(tài)觀察，ITS區(qū)及特異性序列分析表明，貴州修文獼猴桃根結線蟲危害種類主要為南方根結線蟲。

[1]范學科, 黨占平. 獼猴桃根結線蟲病的病原鑒定及其防治[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學,2007(6):71-72.

[2]張紹升, 林尤劍, 高日霞. 福建稱猴桃根結線蟲病病原鑒定[J]. 福建農(nóng)學院學報(自然科學版), 1993,22(4)：433-435.

[3]李淑君, 喻 璋. 河南獼猴桃根結線蟲新種(Meloidogyneactinidiae)[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學學報, 1991(3):251-253.

[4]方炎祖, 羅桂菊, 朱曉香, 等. 湖南獼猴桃根結線蟲病害研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學, 1991(4):40-42.

[5]李添群, 黃亞欣, 朱菊仙, 等. 修文縣獼猴桃根結線蟲的發(fā)生危害調(diào)查及綜合防治技術[J]. 耕作與栽培, 2014(5):68-69.

[6]趙 雷, 郭 愷, 洪文英, 等. 浙江省蔬菜上2種根結線蟲的形態(tài)學鑒定[J]. 浙江大學學報 (農(nóng)業(yè)與生命科學版), 2010,6(6):623-629.

[7]Landa B B, Rius J E P, Vovlas N, et al. Molecular characterization ofMeloidogynehispanica(Nematoda,Meloidogynidae)by phylogenetic analysis of genes within the r DNA in Meloidogyne spp.[J]. Plant Disease, 2008,92:1104-1110.

[8]Conceicao I L, Tzortzakakis E A, Gomes P, et al. Detection of the root-knot nematodeMeloidogyneethiopicainGreece[J]. European Journal of Plant Pathology, 2012,134:451-457.

[9]Vrain T C, Wakarchuk D A, Levesque A C, et al. Intraspecific rDNA restriction fragment length polymorphism in theXiphinemaamericiumgroup[J]. Fund Appl Nematol, 1992,15(6):563-573.

[10]Power T O, Harris T S. A polymerase chain reaction method for five majorMeloidogynespecies[J]. Journal of Nematology, 1993,25:1-6.

[11]Meng Q P, Long H, Xu J H. PCR Assays for Rapid and Sensitive Identification of Three Major Root-Knot Nematodes，Meloidogyneincognita，M.javanicaandM.arenaria[J]. Acta Phytopathologica Sinica, 2004,34(3):204-210.

[12]Zijlstra C, Donkers-Venne D T H M, Fargette M. IdentificationofMeloidogyneincognita，M.javanicaandM.arenariausing sequence characterized amplified region(SCAR)based PCR assays[J]. Nematology, 2000(2):847-853.

[13]張紹升.植物線蟲病害診斷與治理[M]. 福州：福建科學技術出版社，1999: 300-302.

[14]萬新龍, 李建洪, 彭德良.根結線蟲r DNA-ITS片段的克隆與序列分析[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報, 2007,26:624-628.

[15]孫龍華, 廖金鈴, 李迅東, 等. 根結線蟲種群的線粒體DNA分析[J]. 植物病理學報, 2005,35(2):134-140.