“庫”對(duì)可溶性糖及碳氮代謝相關(guān)酶基因表達(dá)影響

潘 冬，張玉磊，同拉嘎，李明月，李 丹，韓云飛，王海微，張忠臣，金正勛

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

【研究意義】可溶性糖是重要的非結(jié)構(gòu)性碳水化合物(non-structural carbohydrate, NSC)，主要包括蔗糖、葡萄糖、果糖等大分子糖類，不僅是高等植物的主要光合產(chǎn)物，而且還是植物體內(nèi)碳水化合物轉(zhuǎn)化、輸運(yùn)、儲(chǔ)藏和再利用的主要形式?？扇苄钥偺恰⒄崽呛偷矸廴咧g的關(guān)系可以互相轉(zhuǎn)化，可溶性糖可作為淀粉合成的底物轉(zhuǎn)化成淀粉，其含量的多少對(duì)籽粒淀粉的積累、細(xì)胞壁的合成及呼吸基質(zhì)均具有重要的作用，具體的轉(zhuǎn)化過程更多地依賴于籽粒庫對(duì)代謝產(chǎn)物的合成及轉(zhuǎn)化能力?？扇苄蕴呛康淖兓c水稻功能葉片光合作用能力有密切相關(guān)[1]。孕穗期又是碳氮代謝旺盛的時(shí)期，可溶性糖是光合作用暗反應(yīng)的主要產(chǎn)物[2]。因此，協(xié)調(diào)可溶性糖的積累與再分配利用很有可能為水稻提高產(chǎn)量和秸稈循環(huán)再利用提供新的途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】RuBP羧化酶是光合作用的關(guān)鍵酶，該酶的活性和含量是評(píng)判植物光合能力的重要指標(biāo)。水稻中核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)是由1個(gè)大亞基和5個(gè)小亞基組成的8聚體，OsRBCS1在水稻葉片中不表達(dá)。蔗糖是植物光合作用的初產(chǎn)物，通過韌皮部以源庫兩端的滲透壓為驅(qū)動(dòng)力運(yùn)輸?shù)綆於耍谙嚓P(guān)酶的催化下分解、重新合成和代謝[3]。已有研究表明，蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase, SPS)、蔗糖合酶(sucrose synthase, SuS)、酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase, AI) 是調(diào)節(jié)水稻CO2同化和蔗糖合成的關(guān)鍵酶[4]。谷氨酰胺合成酶(GS)是無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮的第一步，對(duì)無機(jī)氮素的同化起到關(guān)鍵性的作用。水稻產(chǎn)量的形成主要是淀粉和蛋白質(zhì)合成與積累的過程[5]，十分復(fù)雜的碳氮代謝參與這些過程。因而，研究碳氮代謝過程中上述關(guān)鍵酶活性及基因的表達(dá)量對(duì)闡明產(chǎn)量形成機(jī)理和可溶性糖積累有著重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)選用寒地粳稻穗重型超級(jí)稻品種‘松粳9號(hào)’和穗數(shù)型高產(chǎn)品種‘龍稻11號(hào)’，對(duì)植株可溶性糖積累特性、劍葉中蔗糖代謝酶活性及碳氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)量等進(jìn)行比較分析?！緮M解決的關(guān)鍵問題】旨在為闡明水稻產(chǎn)量形成的分子機(jī)理和提高秸稈循環(huán)再利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗(yàn)方法

選用寒地穗重型超級(jí)稻品種‘松粳9號(hào)’和穗數(shù)型高產(chǎn)品種‘龍稻11號(hào)’，于2015年在哈爾濱東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，盆規(guī)格為直徑30 cm，高35 cm。4月2日播種，大棚盤育苗，單粒等距離點(diǎn)播催芽籽，旱育秧管理，5月10日選取長勢(shì)一致的秧苗等距離插秧，每盆插1穴，每穴插2顆，每個(gè)品種插24盆，正常水肥管理。

施氮量為純氮9 kg/666.7m2，并以盆的表面積換算得出每盆的施肥量。N∶P2O5∶K2O比例為1∶0.5∶1。氮肥為尿素，磷肥為磷酸二銨，鉀肥為硫酸鉀。施肥方法是全部的磷肥和50 %的鉀肥以及總氮肥量的50 %做基肥，于插秧前全層施用?？偟柿康?0 %做分蘗肥施用，總氮肥量的30 %和50 %的鉀肥做穗肥施用。

在抽穗時(shí)，選取生長整齊一致且同一天抽出葉鞘3 cm的稻穗掛牌標(biāo)記，等稻穗完全抽出后分別進(jìn)行剪穗處理。無穗處理是剪去全部稻穗，半穗處理是剪去上半部分稻穗，留下半部分稻穗，全穗處理是保留全部稻穗。自抽穗后第30、35、40天分別取掛牌標(biāo)記的稻穗和葉、莖、鞘，取劍葉中間部分5 cm放入凍存管里，置于-80 ℃冰柜里保存?zhèn)溆?。剩余的葉、莖、鞘，在105 ℃殺青10 min后65 ℃烘干，供可溶性總糖的測定。收獲時(shí)按單株收獲，自然干燥后供室內(nèi)考種和品質(zhì)分析。

1.2 測定方法

1.2.1 可溶性總糖含量測定 采用硫酸蒽酮法[6]測定可溶性糖含量，各樣品重復(fù)測定3次。

1.2.2 葉片蔗糖代謝相關(guān)酶活性測定 參考Rufty[7]和Douglas[8]等的方法，略做改動(dòng)。

酶液的提取。稱取凍存管里的劍葉樣品0.5 g左右，用4倍體積的100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液(內(nèi)含10 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、2 %乙二醇、20 mmol·L-1巰基乙醇)10 mL冰浴中快速研成勻漿，將濾液于4 ℃ 10 000 r/min離心30 min，取上清液置于冰浴，作為粗酶液備用。

蔗糖磷酸合成酶(SPS)活力測定。取0.3 mL的反應(yīng)混合液，內(nèi)含50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.0)、10 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、2 %乙二醇、20 mmol·L-1巰基乙醇、10 mmol·L-16-磷酸果糖(F6P)、3 mmol·L-1UDPG，另加入0.2 mL酶液在30 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在沸水浴保溫4 min，流水冷卻，測定體系中蔗糖含量。

酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶(AI)活力測定。取0.3 mL的反應(yīng)混合液，含50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 4.5)、10 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、2 %乙二醇、20 mmol·L-1巰基乙醇，另加入0.2 mL酶液, 37 ℃反應(yīng)30 min,在沸水浴保溫4 min, 流水冷卻, 測定體系中蔗糖含量。

蔗糖合成酶(SuS)活力測定。取0.3 mL的反應(yīng)混合液，內(nèi)含50 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.0)、10 mmol·L-1MgCl2、2 mmol·L-1EDTA、2 %乙二醇、20 mmol·L-1巰基乙醇、50 mmol·L-1尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)，另加入0.2 mL酶液在37 ℃水浴中反應(yīng)30 min，在沸水浴保溫4 min，流水冷卻，測定體系中蔗糖含量。

1.2.3 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶和谷氨酰胺合成酶基因mRNA表達(dá)量測定 在NCBI上查找相關(guān)文獻(xiàn)獲得基因登錄號(hào)，經(jīng)過多重比對(duì)粳稻基因庫獲得基因保守區(qū)域，使用Primer 5.0及NCBI內(nèi)Primer BLAST功能，在基因保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)高特異性的內(nèi)參基因(OsActin1)和核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)和谷氨酰胺合成酶(GS)基因引物(表1)。

表1 RT-PCR目的基因引物

冷酚法提取劍葉中總RNA，利用RNA-free DNaseI去除基因組DNA污染，反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA模板。

以逆轉(zhuǎn)錄獲取的cDNA為模板擴(kuò)增內(nèi)參基因條帶，PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min—94 ℃ 30 s;52.5 ℃ 30 s;72 ℃ 40 s/30個(gè)循環(huán)—72 ℃ 5 min—16 ℃結(jié)束。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.25 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用Quantity one 7.0.5 軟件對(duì)內(nèi)參基因RT-PCR產(chǎn)物的電泳譜帶亮度進(jìn)行比較分析，調(diào)整體系中cDNA加入量并重復(fù)RT-PCR反應(yīng)至達(dá)到條帶亮度一致，記錄cDNA加入量作為Rubisco和GS基因cDNA模板的加入量，最終得到代表基因表達(dá)豐度的亮度條帶及Quantity one7.0.5條帶亮度平均值的數(shù)值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析使用SPSS和Excel，膠片亮度分析使用Quantity one 7.0.5軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同剪穗處理對(duì)產(chǎn)量性狀的影響

由表2可見，抽穗后30、35 d時(shí)供試的2個(gè)品種半穗處理的千粒重、結(jié)實(shí)率和糙米率均極顯著高于全穗處理，到抽穗后40 d時(shí)半穗處理僅比全穗處理略高，但差異不顯著。說明在同等的“源”條件下減小“庫”容有利于提高籽粒的粒重和成熟度，隨著“庫”容的增加所需的灌漿時(shí)間就越長。

2.2 不同剪穗處理對(duì)植株可溶性總糖含量的影響

由表3可見，供試的2個(gè)品種都表現(xiàn)無穗處理的葉、莖、鞘中的可溶性總糖含量隨灌漿進(jìn)程一直升高的變化趨勢(shì)，但半穗處理和全穗處理是下降的變化趨勢(shì)，而且灌漿不同時(shí)期不同剪穗處理間葉、莖、鞘中的可溶性總糖含量差異都極顯著，無穗>半穗>全穗，說明沒有“庫”容時(shí)光合產(chǎn)物主要貯藏在葉、莖、鞘等營養(yǎng)器官中，但有“庫”容時(shí)主要轉(zhuǎn)移到“庫”中，“庫”越大轉(zhuǎn)移的光合產(chǎn)物也越多。

表2 不同剪穗處理間千粒重、結(jié)實(shí)率、糙米率比較

注：不同小寫字母和大寫字母間分別表示在0.05和0.01水平差異顯著，下同。

Note： Different lowercases and uppercase letters mean significant difference at 0.05 and 0.01 level. The same as below.

表3 灌漿不同時(shí)期不同剪穗處理間植株可溶性總糖含量比較

另一方面，在無穗處理下可溶性總糖含量的分布是莖>葉>鞘，在半穗和全穗處理下可溶性總糖含量的分布是莖>鞘>葉。穗重型超級(jí)稻品種‘松粳9號(hào)’的葉、鞘中的可溶性總糖含量高于穗數(shù)型品種‘龍稻11號(hào)’，而莖中可溶性總糖含量卻‘龍稻11號(hào)’高于‘松粳9號(hào)’。說明“庫”的有無對(duì)可溶性總糖含量分布影響很大，無“庫”時(shí)莖葉是主要貯藏部位，而有“庫”時(shí)莖鞘是主要貯藏部位，而且超級(jí)稻品種合成積累的可溶性總糖含量高于不同品種。

2.3 不同剪穗處理對(duì)葉片蔗糖代謝主要酶活性的影響

由圖1可見，供試的2個(gè)品種抽穗后30～40 d都隨灌漿天數(shù)的增加而SPS、AI、SuS活性呈下降，期間的酶活性大小而言都表現(xiàn)全穗>半穗>無穗，而且處理間差異都達(dá)到極顯著水平，說明“庫”容量越大SPS、AI、SuS酶活性就越強(qiáng)。

2.4 不同剪穗處理對(duì)水稻葉片Rubisco基因mRNA表達(dá)量的影響

圖1 灌漿不同時(shí)期不同剪穗處理間葉片蔗糖代謝主要酶活性比較Fig.1 Comparison of the main enzyme activities of sucrose metabolism in leaves of between different cutting modes at grain filling stage

圖2灌漿不同時(shí)期不同剪穗處理間葉片Rubisco基因家族mRNA表達(dá)量比較Fig.2 Rubisco gene expression in leaves with different cuttings at grain filling stage

圖3 在灌漿期不同剪穗處理下葉片谷氨酰胺合成酶基因表達(dá)量Fig.3 GS gene expression in leaves under different treatments at grain filling stage

由圖2可見，供試的2個(gè)品種在抽穗后30、35、40 d葉片中Rubisco大亞基和小亞基基因表達(dá)量大小都表現(xiàn)為全穗>半穗>無穗，說明“庫”容量越大葉片中Rubisco大亞基和小亞基基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量也越高。由圖2還可見，抽穗后30 d起隨著灌漿時(shí)間的延長不同剪穗處理的2個(gè)供試品種葉片Rubisco大亞基和小亞基基因的mRNA表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。在Rubisco基因家族中大亞基基因OsRBCSL基因的mRNA表達(dá)量明顯高于其它基因，而其它基因彼此間mRNA表達(dá)量差異很小，說明OsRBCSL基因是在灌漿過程中Rubisco基因家族中主要表達(dá)的基因。

2.5 不同剪穗處理對(duì)葉片谷氨酰胺合成酶基因mRNA表達(dá)量的影響

由圖3可見，供試的2個(gè)品種在抽穗后30、35、40 d葉片中谷氨酰胺合成酶基因mRNA表達(dá)量大小均呈為全穗>半穗>無穗，說明“庫”容量越大葉片中谷氨酰胺合成酶基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量也越高。

在不同的剪穗處理下隨著灌漿時(shí)間的延長，葉片OsGS1;1和OsGS2基因mRNA表達(dá)量逐漸下調(diào)。OsGS1;1基因在灌漿過程中mRNA表達(dá)量均最大，說明OsGS1;1基因在灌漿過程中是GS基因主要表達(dá)的基因。穗重型品種‘松粳9號(hào)’OsGS1;1和OsGS2基因表達(dá)量下降趨勢(shì)差異不顯著，30～35 d下調(diào)幅度大，35～40 d下調(diào)幅度小。穗數(shù)型品種‘龍稻11號(hào)’OsGS1;1基因和穗重型品種‘松粳9號(hào)’OsGS1;1和OsGS2基因表達(dá)量下調(diào)趨勢(shì)基本一致。穗數(shù)型品種‘龍稻11號(hào)’OsGS2基因表達(dá)量下調(diào)趨勢(shì)30～35 d下調(diào)幅度小，35～40 d下調(diào)幅度大。以上結(jié)果說明“庫”容量越大，水稻葉片中GS基因表達(dá)量越高，隨著灌漿時(shí)間的延長，GS基因表達(dá)量均下調(diào)。

2.6 葉片蔗糖代謝相關(guān)酶活性與碳氮代謝基因表達(dá)量間的相關(guān)關(guān)系

由表4可見，葉片蔗糖磷酸合成酶(SPS)、酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶(AI)、蔗糖合成酶(SuS)等3個(gè)蔗糖代謝相關(guān)酶活性與Rubisco同工型基因和谷氨酰胺合成酶同工型基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量間均呈極顯著的正相關(guān)，說明Rubisco同工型基因和谷氨酰胺合成酶同工型基因的上調(diào)表達(dá)會(huì)促進(jìn)蔗糖代謝相關(guān)酶活性。

3 討 論

表4葉片蔗糖代謝相關(guān)酶活性與碳氮代謝基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量間的相關(guān)系數(shù)

Table 4 The correlation coefficients between sucrose metabolism related enzymes activities and carbon and nitrogen metabolic gene transcriptional expression in leaf

SPSAISuSOsRBCS20 942??0 938??0 771??OsRBCS30 864??0 784??0 580??OsRBCS40 943??0 857??0 581??OsRBCS50 893??0 900??0 735??OsRBCSL0 846??0 937??0 883??GS1；10 909??0 910??0 717??GS20 806??0 911??0 844??

注： ** 表示達(dá)1 %極顯著水平。

Note： ** indicate different significance at 1 % level.

水稻秸稈的飼料加工不僅有利于提高水稻秸稈的綜合利用率，緩解我國飼料糧緊缺狀況，而且有利于實(shí)現(xiàn)物質(zhì)流的良性循環(huán)和寒地稻作區(qū)的秸稈還田，進(jìn)而減少秸稈的燃燒量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。水稻秸稈中可溶性碳水化合物可以促進(jìn)乳酸發(fā)酵，為微生物提供能量。通過秸稈的生物發(fā)酵把秸稈粗纖維中大分子碳水化合物降解為低分子的單糖或多糖，轉(zhuǎn)變秸稈中的不可溶性碳水化合物為可溶性碳水化合物，使秸稈轉(zhuǎn)變成飼料。因此，秸稈中可溶性碳水化合物含量高低是影響是否適合做飼料的重要因素之一[9]。在我國水稻主要以糧食作物栽培，栽培重點(diǎn)是提高水稻籽粒產(chǎn)量和品質(zhì)等，從秸稈飼用方面研究報(bào)道甚少。本文從秸稈飼用開發(fā)層面研究了灌漿成熟期秸稈可溶性總糖含量變化規(guī)律。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，無穗處理的葉、莖、鞘中的可溶性總糖含量隨灌漿進(jìn)程呈一直升高的變化趨勢(shì)，但半穗處理和全穗處理是下降的變化趨勢(shì)，沒有“庫”容時(shí)可溶性糖主要貯藏在葉、莖、鞘等營養(yǎng)器官中，但有“庫”容時(shí)主要轉(zhuǎn)移到“庫”中，而且“庫”越大轉(zhuǎn)移的可溶性糖也越多。因此，作為糧食和飼料兼用的水稻品種不宜選育“庫”大的穗重型品種，應(yīng)該選育“庫”容中等的穗數(shù)型品種。而且，在生產(chǎn)上應(yīng)注意灌漿后期植株可溶性糖含量的變化，收獲時(shí)期不宜過完，以免植株可溶性糖含量過低而影響秸稈的飼料生產(chǎn)及質(zhì)量。

水稻籽粒的灌漿物質(zhì)來源于抽穗前莖鞘NSC和抽穗后的光合產(chǎn)物[10]。潘俊峰[11]等研究結(jié)果表明，莖鞘NSC作為臨時(shí)儲(chǔ)藏物質(zhì)能夠在籽粒灌漿成熟期光合能力降低時(shí)為產(chǎn)量形成持續(xù)提供同化物，并且莖鞘NSC能夠激發(fā)庫活性以及促進(jìn)籽粒灌漿。翁仁憲等[12]則指出，水稻抽穗期莖鞘中NSC的累積與抽穗至成熟期增加的干重對(duì)結(jié)實(shí)率和產(chǎn)量的作用前者更重要。潘慶民[13]等曾對(duì)小麥開花后旗葉中蔗糖的合成與籽粒中蔗糖的降解進(jìn)行研究指出，旗葉中的蔗糖含量與SPS活性呈顯著正相關(guān)，SPS活性又與旗葉光合速率呈極顯著正相關(guān)，而旗葉和籽粒中SuS活性均與籽粒淀粉的積累速率呈極顯著正相關(guān)。孫慶泉等[14]發(fā)現(xiàn)，玉米籽粒中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性與籽粒充實(shí)有關(guān)，較高的轉(zhuǎn)化酶活性有利于玉米的高產(chǎn)。水稻籽粒中的AI活性在籽粒灌漿前期活性較灌漿后期高，與SuS一起通過對(duì)蔗糖的降解來調(diào)控籽粒生長[15]。翁曉燕等[16]研究水稻光合速率、Rubisco及Rubisco活化酶活力的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，水稻劍葉衰老過程中光合能力的下降與Rubisco活化酶表達(dá)密切相關(guān)。Martinez等[17]發(fā)現(xiàn)玉米低產(chǎn)品系中Rubisco活化酶含量很低，若人為提高Rubisco活化酶水平，則Rubisco和光合速率都隨之上升，產(chǎn)量也增加。董明輝等[18]研究表明，籽粒中谷氨酰胺合成酶與抽穗后氮素運(yùn)轉(zhuǎn)率、籽粒吸氮量和產(chǎn)量均呈顯著的正相關(guān)。孫國榮等[19]表明，在生殖生長期谷氨酰胺合成酶活性均與產(chǎn)量性狀有密切關(guān)系，谷氨酰胺合成酶活性可通過調(diào)控營養(yǎng)生長期稻株氨代謝而影響生殖生長，最終影響產(chǎn)量。魏穎娟等[20]研究結(jié)果表明，可溶性糖含量與光合速率呈極顯著負(fù)相關(guān)，平均籽粒灌漿速率與品種的穗粒類型密切相關(guān)，其中，大粒型品種為0.68 mg·d-1，中粒型品種為 0.48～0.51 mg·d-1，小粒型品種為 0.41～0.47 mg·d-1。由本試驗(yàn)結(jié)果可知，無論是“庫”容大小如何隨著灌漿時(shí)間的延長，葉、莖、鞘的可溶性總糖含量都緩慢減少，而千粒重、結(jié)實(shí)率、糙米率等緩慢增加，隨著“庫”容的增加所需的灌漿時(shí)間也隨之變長。籽粒灌漿后期劍葉的 SPS、AI、SuS活性均呈下降趨勢(shì)，期間的酶活性大小表現(xiàn)為全穗>半穗>無穗，“庫”容量越大SPS、AI、SuS酶活性以及Rubisco和谷氨酰胺合成酶同工型基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量也越高，但受葉片可溶性糖含量的反饋調(diào)節(jié)作用而酶活性和基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量也均下降，與前人的眾多研究結(jié)果相一致。

4 結(jié) 論

因此，擴(kuò)大“庫”容和建立暢通的“流”組織即時(shí)轉(zhuǎn)移“源”中的光合產(chǎn)物，進(jìn)而促進(jìn)Rubisco同工型基因和谷氨酰胺合成酶同工型基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及蔗糖代謝相關(guān)酶活性是獲得更多碳水化合物的重要途徑。由于隨著“庫”容量的增加而灌漿所需時(shí)間也變長，因此水稻高產(chǎn)或超高產(chǎn)栽培不僅要構(gòu)建大的“庫”容量，而且還要保證灌漿時(shí)間，這對(duì)提高粒重和結(jié)實(shí)率以及籽粒成熟度均具有重要作用。

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