銀鯧染色體核型研究

周劍光，張 林，張晨捷，張 濤，彭士明

1.農(nóng)業(yè)部淡水魚(yú)類(lèi)種質(zhì)監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090）

銀鯧（Pampus argenteus）俗稱(chēng)“鏡魚(yú)”，隸屬于硬骨魚(yú)綱（Osteichthyes），鱸形目（Perciformes），鯧亞目 （Stromateoidei），鯧 科 （Stromateidae）、鯧屬［1］，分布于印度洋、西太平洋，從波斯灣到印尼等海域。為中國(guó)近海的常見(jiàn)魚(yú)類(lèi)，東海、南海與黃渤海較多［2-3］。喜歡在淺海巖礁、沙灘水深10～20 m一帶河口處產(chǎn)卵，為海洋洄游性魚(yú)類(lèi)，生活于5～110m海域，幼魚(yú)喜躲藏在漂浮物下面，成魚(yú)則常與金線(xiàn)魚(yú)、鰏魚(yú)或?qū)ξr等混游［4-5］。肉食性，食物以水母及浮游動(dòng)物為主。銀鯧是名貴的海產(chǎn)食用魚(yú)類(lèi)之一，肉質(zhì)細(xì)嫩且刺少，含豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是網(wǎng)箱養(yǎng)殖的優(yōu)良品種。

迄今為止，有關(guān)銀鯧的研究主要集中在銀鯧生物學(xué)、增養(yǎng)殖及分子克隆等方面，而銀鯧的細(xì)胞遺傳學(xué)及核型研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用PHA和秋水仙素腹腔注射、腎細(xì)胞直接制片法對(duì)銀鯧染色體核型進(jìn)行了初步研究，以期為該魚(yú)的細(xì)胞遺傳學(xué)特性研究提供數(shù)據(jù)資料，為探究該物種起源及進(jìn)化地位及指導(dǎo)遺傳育種生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為東海水產(chǎn)研究所福鼎基地人工繁殖的1齡銀鯧，用于染色體組型分析的8 ind（4雌4雄）銀鯧，體質(zhì)量15～32 g。實(shí)驗(yàn)用魚(yú)從福鼎基地養(yǎng)殖池中取出后，放入直徑2 m的玻璃鋼盆中，為防止銀鯧出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，玻璃鋼盆中事先加海水至80～100 cm，并加蓋黑色的遮陽(yáng)布。水溫控制在25℃。

1.2 染色體標(biāo)本制作

染色體標(biāo)本制備采用林義浩［6］的體內(nèi)注射腎細(xì)胞法，稍加修改，方法如下：

（1）注射PHA（植物血球凝集素）和秋水仙素。

自實(shí)驗(yàn)魚(yú)胸鰭基部注射PHA溶液（0.9%NaCl配制濃度為1 000μg·mL-1），劑量10～15 μg·g-1（魚(yú)體質(zhì)量）；注射20～24 h后胸鰭基部注射秋水仙素溶液（0.9%NaCl配制濃度為1 000 μg·mL-1），劑量5～8μg·g-1（魚(yú)體質(zhì)量）。

（2）剪鰓失血。注射秋水仙素溶液2～4 h后，把實(shí)驗(yàn)魚(yú)剪鰓放血5～10 min，魚(yú)死前取出頭腎、中腎，用生理鹽水反復(fù)洗滌。

（3）制備細(xì)胞懸液。將腎組織塊置于裝有少許生理鹽水的小燒杯中，用小剪刀剪碎腎組織，加入生理鹽水，用100目尼龍紗絹過(guò)濾。

（4）離心洗滌細(xì)胞。將濾液移入離心管1 000 r·min-1離心 8 min。

（5）低滲處理。0.075 mol·L-1KCl低滲處理50～60 min。

（6）固定。在低滲液上加少許固定液（甲醇3：冰醋酸1，以下同），用吸管吹打混勻進(jìn)行預(yù)固定3～4 min，隨后1 000 r·min-1離心8 min（以下時(shí)間同）。再重復(fù)固定3次，每次20 min。

（7）滴片。將細(xì)胞懸浮液滴于預(yù)冷載玻片上，隨后將載玻片在酒精燈上過(guò)火2～3次，自然干燥后用15%姬姆薩染色30 min，蒸餾水將反面沖洗干凈，自然干燥后鏡檢。

1.3 染色體眾數(shù)確定及組型分析

染色體眾數(shù)及組型分析參照TAN等［7］的方法進(jìn)行。稍加修改，方法如下：

（1）染色體計(jì)數(shù)

選取來(lái)自不同個(gè)體的100個(gè)分散良好的細(xì)胞，用顯微鏡（油鏡下）進(jìn)行觀(guān)察、拍照，根據(jù)眾數(shù)確定二倍體染色體數(shù)目。

（2）組型分析

挑選最好的10個(gè)數(shù)目完整、分散良好、長(zhǎng)度適中（正中期）、著絲點(diǎn)清楚、2條單體適度分開(kāi)、形態(tài)清晰的分裂相進(jìn)行顯微攝影，在相片上對(duì)每一條染色體確認(rèn)著絲點(diǎn)位置，分別測(cè)量長(zhǎng)臂和短臂，測(cè)量數(shù)據(jù)取其平均值。計(jì)算其相對(duì)長(zhǎng)度、臂比值和著絲點(diǎn)指數(shù)，并按LEVAN［8］提出的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配對(duì)、分類(lèi)、排列組型。

2 結(jié)果

2.1 銀鯧二倍體染色體數(shù)目

統(tǒng)計(jì)8 ind銀鯧共100個(gè)中期分裂相的結(jié)果（表1），其中染色體總數(shù)為48的分裂相細(xì)胞占全部計(jì)數(shù)細(xì)胞的70%，由此確定銀鯧的二倍體染色體數(shù)目為2N＝48（圖1）。對(duì)于具有非眾數(shù)染色體的分裂相，可能是低滲或滴片過(guò)程中少量染色體丟失而造成。

圖1 銀鯧的染色體中期分裂相（×1 000）Fig.1 Themetaphase chromosomes of Pampus argenteus（×1 000）

表1 銀鯧染色體數(shù)目的分布Tab.1 Distribution of chromosome numbers of Pampus argenteus

2.2 銀鯧的染色體組型

根據(jù)對(duì)銀鯧染色體相對(duì)長(zhǎng)度和臂比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表 2），其全部染色體可配成 24對(duì)，按LEVAN命名法［8］分成4組，M組（中部著絲點(diǎn)染色體，r＝1.00～1.70）1對(duì)；SM組（亞中部著絲點(diǎn)染色體，r＝1.71～3.00）3對(duì)；ST組（亞端部著絲點(diǎn)染色體 r＝3.01～7.00）5對(duì)；T組（端部著絲點(diǎn)染色體，r＝7.01～∞）15對(duì)。按相對(duì)長(zhǎng)度排列，制成銀鯧染色體組型圖（圖2），核型公式為2N＝2M+6SM+10ST+30T，臂數(shù)（NF）＝56。從圖2可以看出，在銀鯧的SM組中，有一對(duì)相對(duì)本組其它染色體明顯較大的染色體，除此之外，各相鄰兩對(duì)染色體之間無(wú)明顯差異，大小呈遞減趨勢(shì)排列。4組染色體均未發(fā)現(xiàn)帶有特殊標(biāo)志性特征如隨體、次縊痕的染色體，也未發(fā)現(xiàn)與性別決定有關(guān)的異形性染色體。

表2 銀鯧染色體核型數(shù)據(jù)Tab.2 Numeral characteristics of the karyotype of Pampus argenteus show ing themean values ofmeasurements from ten bestm itoticmetaphases

圖2 銀鯧染色體組型（標(biāo)尺 ＝5μm）Fig.2 The karyotype of Pampus argenteus（Bar＝5μm）

3 討論

鱸形目種類(lèi)繁多，是脊椎動(dòng)物中種類(lèi)最多的一個(gè)目（約7800種）［9］。目前已報(bào)道的鱸形目506種魚(yú)類(lèi)中二倍體的染色體數(shù)目及核型顯示出一定的相似性：約60%的種類(lèi)2N＝48，但在染色體組型和臂數(shù)上存在一定差異［10］。本文首次報(bào)道了鯧屬魚(yú)類(lèi)染色體，對(duì)其核型進(jìn)行了初步研究。銀鯧M組染色體數(shù)為2，SM組染色體數(shù)為6，這一結(jié)果與舒琥等［11］報(bào)道的卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）染色體組型相似，染色體臂數(shù)相同，似乎說(shuō)明這2種魚(yú)的親緣關(guān)系較近。而與舒琥等［12］報(bào)道的紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）組型卻存在一定出入，而且染色體臂數(shù)也有差異。相同之處是均未發(fā)現(xiàn)帶有隨體、次縊痕的染色體。這些現(xiàn)象反映了魚(yú)類(lèi)種間、類(lèi)群間進(jìn)化上的趨同性和變異性。但要判定鱸形目?jī)?nèi)的系統(tǒng)發(fā)育及親緣關(guān)系，需要借助形態(tài)學(xué)、生化和分子生物學(xué)方法做進(jìn)一步分析。王金星等［13］利用采自青島和煙臺(tái)近海的5種鱸形目魚(yú)類(lèi)所得到的核型均為2N＝48＝48T，與本文及上述報(bào)道差異很大，造成這些差異的原因可能是由于鱸形目不同種屬染色體多態(tài)現(xiàn)象，但更有可能是由于不同種屬內(nèi)客觀(guān)存在的染色體核型分化所致。

日本學(xué)者小島吉雄對(duì)800余種已作核型研究的魚(yú)類(lèi)染色體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)［14］，高位類(lèi)群的魚(yú)類(lèi)染色體的特點(diǎn)是其數(shù)目分布呈收斂狀態(tài)較集中，局限在2N＝42～48的范圍內(nèi)，峰值是2N＝48，M型（包括M和SM染色體）少，A型染色體（包括ST和T染色體）多。銀鯧2N＝48，M型染色體數(shù)目為8，A型染色體為40，NF＝56，為典型的高位類(lèi)群染色體數(shù)目。因此，在魚(yú)類(lèi)系統(tǒng)上屬于高位類(lèi)群，與系統(tǒng)演化上的低位類(lèi)群如鯉形目、鯰形目大多數(shù)種類(lèi)核型中M型染色體所占比例大（超過(guò) 50%）、A型染色體比例?。ㄐ∮?0%）、NF值高的特點(diǎn)相比，有著明顯的區(qū)別。

魚(yú)類(lèi)特別是淡水魚(yú)類(lèi)染色體組型的研究，國(guó)內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，還有專(zhuān)著出版［15］，但是海水魚(yú)類(lèi)染色體組型的報(bào)道則不多見(jiàn)，不到現(xiàn)存海洋魚(yú)類(lèi)的5%［16］，既分散又不系統(tǒng)。在已有核型報(bào)道的海洋魚(yú)類(lèi)中，2N＝48的占多數(shù)。鯧科魚(yú)類(lèi)染色體研究除本文報(bào)道的銀鯧外尚未見(jiàn)其它報(bào)道，整個(gè)鯧科魚(yú)類(lèi)的核型特征還有待進(jìn)一步研究。同時(shí)，海水魚(yú)類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)的系統(tǒng)研究應(yīng)該進(jìn)一步加強(qiáng)。

筆者在銀鯧的染色體標(biāo)本制備過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)銀鯧具有很強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)，往往在操作后短短幾個(gè)小時(shí)內(nèi)魚(yú)即死亡，給實(shí)驗(yàn)造成了很大困難。經(jīng)過(guò)反復(fù)摸索，我們發(fā)現(xiàn)采用如下方法可有效減緩銀鯧在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的應(yīng)激反應(yīng)：1）從暫養(yǎng)池?fù)启~(yú)時(shí)，魚(yú)全程不能離水，必須帶水操作；2）注射PHA和秋水仙素時(shí)，事先用丁香酚麻醉實(shí)驗(yàn)魚(yú)；3）注射藥物時(shí)，盡量在水面下操作；4）注射藥物后，實(shí)驗(yàn)魚(yú)的暫養(yǎng)容器水位保持在80～100cm，上面遮蓋黑色遮陽(yáng)布避光。這個(gè)防應(yīng)激的方法在同樣具有強(qiáng)應(yīng)激反應(yīng)的刀鱭（Coilia ectenes），鰣魚(yú)（Tenualosa reevesii）的實(shí)驗(yàn)操作中也可借鑒使用。

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