海七鰓鰻CXCL8基因的原核表達(dá)及蛋白純化

朱欣云，丁少青，張 哲，任建峰，2，濮家飛，賈 亮，李偉明，張慶華，2

（1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.上海海洋大學(xué)，水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；3.密歇根州立大學(xué)漁業(yè)與野生生物系，東蘭辛，密歇根，美國 4883224）

趨化因子是一類具有趨化功能和活化作用的小分子分泌型蛋白質(zhì)，由單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌產(chǎn)生，分子量大小通常為8～15 kDa。趨化因子在從最低等的魚類到哺乳類的整個脊椎動物中均有廣泛的表達(dá)，它們的起源甚至可以追溯到距今約5.2億年前古老的脊索動物文昌魚（Branchiotoma belcheri）［1］。趨化因子在炎癥反應(yīng)、病原體感染及清除、細(xì)胞及器官發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、腫瘤形成及轉(zhuǎn)移、移植排異等方面都起著重要的作用［2］。目前已在人和小鼠中發(fā)現(xiàn)近50種趨化因子，根據(jù)氨基酸序列中N端保守的半胱氨酸殘基（Cys）的數(shù)目和位置的差別，將哺乳動物中的趨化因子分為4個類型：CC型、CXC型、C型和 CX3C型［3］。2008年，PEATMAN等［4］在斑馬魚（Danio rerio）中又發(fā)現(xiàn)一種特有的CX型趨化因子，該亞類共有4個成員，到目前為止，斑馬魚中共發(fā)現(xiàn)111種趨化因子，這可能與斑馬魚的基因組中有一次額外的基因加倍有關(guān)［5-6］。趨化因子作為配體通過和細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用［7］。

CXCL8，又稱為白細(xì)胞介素8（interleukin 8，IL-8），是常見的趨化因子，屬于C-X-C型亞家族。1987年，YOSHIMURA等［8］從細(xì)菌刺激后的人外周血單核細(xì)胞的上清液中分離純化得到第一個趨化因子CXCL8，發(fā)現(xiàn)其對中性粒細(xì)胞有趨化作用，因此被命名為粒細(xì)胞激活因子。之后的研究認(rèn)為其屬于白細(xì)胞介素家族成員，在1988年倫敦學(xué)術(shù)會議上將該因子確定為中性粒細(xì)胞活性肽（Neutrophil Alkaline Phosphatase）／CXCL8。迄今為止，在許多脊椎動物中都已鑒定到CXCL8的基因，包 括 人 （Homo sapiens）［9］、雞 （Gallus gallus）［10］、爪蟾（Xenopus laevis）［11］、斑馬魚［12］和河七鰓鰻（Lampetra fluviatilis）［13］。CXCL8是促炎性細(xì)胞因子，能夠趨化中性粒細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，促使其脫顆粒，引起呼吸暴發(fā)反應(yīng)；并激活炎性細(xì)胞，如：吞噬細(xì)胞，促進(jìn)急性期蛋白合成，參與炎癥反應(yīng)，引起發(fā)熱。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CXCL8能夠?qū)Σ煌愋偷募?xì)胞產(chǎn)生作用，促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程、誘導(dǎo)血管的生成、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂、調(diào)節(jié)免疫功能等，與多種炎癥反應(yīng)性疾病、免疫性疾病以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系［9］。

七鰓鰻屬圓口綱（Cyclostomata），七鰓鰻目（Petromyzoniformes），七鰓鰻科（Petromyzontidae），為無頜類脊椎動物。七鰓鰻是目前所存的最古老的無頜類脊椎動物之一，是聯(lián)系無脊椎動物與脊椎動物的重要橋梁，其免疫系統(tǒng)介于無脊椎動物（只擁有先天免疫）和硬骨魚（部分獲得性免疫）之間［14］，對其免疫系統(tǒng)的研究在理論上有著重要的進(jìn)化意義。雖然目前已確定的七鰓鰻有38種，但經(jīng)常以全基因組測序已經(jīng)完成的海七鰓鰻（Petromyzon marinus）和日本七鰓鰻（Lethenteron japonicum）作為典型代表［15］。本研究通過PCR方法得到海七鰓鰻CXCL8的cDNA序列，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并誘導(dǎo)表達(dá)出PmCXCL8重組蛋白，以期為進(jìn)一步研究海七鰓鰻CXCL8的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

pCold I質(zhì)粒、克隆載體 PMD19-T、感受態(tài)細(xì)菌DH5α和BL21購買于TaKaRa公司，感受態(tài)細(xì)菌Rosetta（DE3）和海七鰓鰻肝組織cDNA為本實驗室保存。

1.2 主要試劑和儀器

Profinia IMAC蛋白質(zhì)純化試劑盒購買于BIO-RAD公司；Penta-His Antibody（Code：34660）抗體購買于 QIAGEN公司；HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG（Code：61-6520）抗體購買于 Invitrogen公司；超聲破碎儀器（SONICS公司，VCX150），蛋白質(zhì)純化儀（BIO-RAD公司，Profinia）。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)已知的海七鰓鰻基因組信息（http：／／www.ensembl.org／index.html），通過 blast方法找到海七鰓鰻的CXCL8（PmCXCL8）基因的開放閱讀框（open reading frame，ORF）序列，設(shè)計出一對引物，上游引物加入NdeI酶切位點，下游引物加入HindⅢ酶切位點，引物序列如下：

CXCL8-F：5’-TCGAAGGTAGGCATATGACG ATGAACGCCAAGCT-3’

CXCL8-R：5’-GCAGGTCGACAAGCTTTCAC GGCGTGGGTTTGGGTG-3’

1.4 目的基因的擴(kuò)增及分析

使用 Tks Gflex?DNA Polymerase，以海七鰓鰻肝cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用25μL PCR體系：Premix 12.5μL，ddH2O 9.5μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA 1μL。反應(yīng)條件：94℃，2 min；98℃，10 s；60℃，30 s；72℃，2 min；30個循環(huán)，72℃10 min，4℃延伸。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時取100μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0切膠回收目的片段，取10μL膠回收產(chǎn)物送測序。

將PCR得到的PmCXCL8基因序列在National Center of Biotechnology Information（NCBI）網(wǎng)站上（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／BLAST）進(jìn)行序列比對，使用 SignalP 4.1 Server（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／SignalP／）進(jìn)行信號肽預(yù)測，使用DNAMAN 8.0進(jìn)行氨基酸序列比對，使用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 表達(dá)載體的構(gòu)建

將1.4中膠回收后的目的片段和pColdI質(zhì)粒使用NdeⅠ酶和HindⅢ酶進(jìn)行雙酶切過夜，回收酶切后的產(chǎn)物，使用In-Fusion?HD Cloning Kit連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布平板，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，送測序進(jìn)行鑒定，原核表達(dá)載體命名為pCold-CXCL8。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及檢測

將pCold-CXCL8質(zhì)粒和pColdI空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）菌株中。分別挑取單克隆培養(yǎng)成種子液，然后使用5 mL LB／Amp（100μg·mL-1）培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)至OD600nm值約為0.6，15℃靜置15 min，添加100 mM IPTG 50μL（終濃度為1 mM）進(jìn)行誘導(dǎo)，15℃繼續(xù)培養(yǎng)22 h。收集菌體后進(jìn)行超聲波破碎和離心分離。取各變性后的樣品（全蛋白、上清、沉淀）8μL（0.05 OD相當(dāng)），進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，使用CBB-R250染色檢測。同時進(jìn)行SDSPAGE電泳及Western blot實驗，一抗使用Penta-His Antibody（1∶3000稀釋），二抗使用 HRPRabbit Anti-Mouse IgG（1∶3000稀釋），使用化學(xué)發(fā)光法顯色檢測。

1.7 重組蛋白的純化及檢測

用1.6中培養(yǎng)的400 mL帶有pCold-CXCL8載體的Rosetta（DE3）感受態(tài)菌液，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，對菌體超聲破碎后離心收集上清，使用Bio-Rad IMAC蛋白質(zhì)純化試劑盒和Profinia蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，純化方法參照說明書進(jìn)行，純化后的蛋白以相同的條件進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 海七鰓鰻CXCL8基因擴(kuò)增結(jié)果及序列分析

PCR結(jié)果顯示在大約300 bp的位置擴(kuò)增出單一條帶，與預(yù)期的大小一致（圖1）。測序結(jié)果表明PmCXCL8基因的ORF為309 bp，該基因編碼102個氨基酸，分子量為11.23 kDa，等電點為9.37。經(jīng)預(yù)測，PmCXCL8信號肽切割位點在第23位和第24位氨基酸之間，前23個氨基酸序列屬于信號肽部分（圖2-a）。在與人（Homo sapiens，P10145.1）、猴（Macaca mulatta，P67813.1）、土撥鼠 （Marmota monax，ABY67262.1）、牛 （Bos taurus，P79255.1）、豬（Sus scrofa，P26894.1）和兔（Oryctolagus cuniculus，P19874.2）這 6種哺乳動物，雞（Gallus gallus，P08317.1）、灰雁（Anser anser，ABD49205.1） 和 鴿 子 （Columba livia，ABD49206.1） 這 3 種 鳥 類， 黑 線 鱈（Melanogrammus aeglefinus，CAD97422.2）、大西洋鱈 （Gadus morhua，ABV59376.1）、虹 鱒（Oncorhynchus mykiss，CAC83945.1）、草 魚（Ctenopharyngodon idella，AEM05971.1）、斑馬魚（Danio rerio，CCQ 71734.1）、鯉（Cyprinus carpio，BAH98111.1）、 河 豚 （Takifugu rubripes，BAD26621.1）、大 黃 魚 （Larimichthys crocea、AKM12660.1）、牙 鲆 （Paralichthys olivaceous，AAL05442. 1）、 鯰 （Ictalurus punctatus，AKQ06246.1）、 真 鯛 （Pagrus major，AHC69388.1）、條 石 鯛 （Oplegnathus fasciatus，AHC69385.1）和 青 鳉 （Oryzias latipes，XP_004065776.1）這 13種魚類及爪蟾 （Xenopus laevis，AEB96252.1）與 河 七 鰓 鰻 （Lampetra fluviatilis，CAA13114.1）的氨基酸序列進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列上存在有與其它趨化因子相同的4個保守的半胱氨酸殘基的典型排列，分別為 C36、C38、C63與 C80位點，同時發(fā)現(xiàn)在PmCXCL8的 CXC基序前沒有 ELR（Gly-Gly-Arg）基序，而由 GGR（Gly-Gly-Arg）基序所替代（圖2-b）。與七鰓鰻、硬骨魚類和其它脊椎動物的CXCL8氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析后發(fā)現(xiàn)，海七鰓鰻和河七鰓鰻的CXCL8的親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)95%，聚為一支，并與硬骨魚類聚為一總支，同時在此總支內(nèi)未與其它魚類聚為同一亞支（圖3）。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增PmCXCL8基因序列Fig.1 RT-PCR amplified fragment of Pm CXCL8

圖2 海七鰓鰻CXCL8鑒定和特征描述Fig.2 Identification and characterization of PmCXCL8

圖3 CXCL8氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of CXCL8 predicted sequences

圖4 pCold-CXCL8表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expressed product of pCold-CXCL8

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.2.1 SDS-PAGE結(jié)果

SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒pCold-CXCL8的 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在預(yù)期位置（PmCXCL8重組蛋白預(yù)測的分子量為14.23 kDa）有1條蛋白條帶，而插入空載體的菌株誘導(dǎo)后未出現(xiàn)該條帶（圖4）。結(jié)果表明重組質(zhì)粒pCold-CXCL8在E.coli BL21和Rosetta（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)了目的蛋白，而且，在E.coli Rosetta（DE3）中表達(dá)的條帶比 E.coli BL21深，在上清中條帶要比沉淀中深，說明目的蛋白在E.coli Rosetta（DE3）中獲得了更好的可溶性表達(dá)。

2.2.2 Western blot結(jié)果

使用Penta-His Antibody鼠單克隆抗體對重組蛋白進(jìn)行Western blot鑒定，結(jié)果顯示，在預(yù)期（PmCXCL8重組蛋白預(yù)測分子量為14.23 kDa，其中融合頭大小為3 kDa，故目的蛋白的分子量為11.23 kDa）位置有單一的條帶（圖5）。說明有目的蛋白表達(dá)，在E.coli Rosetta（DE3）中條帶比E.coli BL21中要深，說明在 E.coli Rosetta（DE3）中的表達(dá)結(jié)果優(yōu)于E.coli BL21，之后利用E.coli Rosetta（DE3）作為后續(xù)蛋白表達(dá)及純化的表達(dá)系統(tǒng)。

2.3 重組蛋白的純化

經(jīng)E.coli Rosetta（DE3）蛋白表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)后得到目的蛋白，使用Bio-Rad IMAC蛋白質(zhì)純化試劑盒和Profinia蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)進(jìn)行純化后，測得濃度為0.04 mg·mL-1，用 SDS-PAGE膠（圖6-a）和 Western blot（圖 6-b）檢測，可發(fā)現(xiàn)清晰、明顯的目的蛋白條帶，經(jīng)Bio-Rad Image Lab 5.1軟件分析，目的蛋白純度大于85%。

圖5 pCold-CXCL8表達(dá)產(chǎn)物W estern blot分析Fig.5 W estern b lot analysis of the expressed p roduct of pCold-CXCL8

3 討論

細(xì)胞趨化因子CXCL8在哺乳動物的炎癥反應(yīng)中將白細(xì)胞招募至炎癥位點的過程中起著重要作用［16］，且其趨化活性已在鯉、斑馬魚、虹鱒、牙鲆和大黃魚中利用重組蛋白得到驗證［17-20］。到目前為止，雖在河七鰓鰻中已鑒定出CXCL8基因，但其趨化功能未見報道。本研究從海七鰓鰻中發(fā)現(xiàn)并鑒定出與其它物種具有同源性的CXCL8蛋白，經(jīng)分析，該蛋白擁有4個半胱氨酸位點，對于其形成特定的三級結(jié)構(gòu)并發(fā)揮CXC趨化因子功能極其重要，靠近N端的2個半胱氨酸殘基之間被1個谷氨酰胺殘基隔開，這些特點均與其它物種的CXC趨化因子亞家族一致［21］。海七鰓鰻CXCL8與河七鰓鰻CXCL8氨基酸序列有95%的一致性，而且它們的分子結(jié)構(gòu)中均沒有ELR基序，這一特點也與除了黑線鱈和大西洋鱈之外的大多數(shù)魚類相一致［1］。ELR基序在哺乳動物中起著招募中性粒細(xì)胞、促進(jìn)血管再生的作用［22］。PmCXCL8分子中的 ELR結(jié)構(gòu)的相應(yīng)位置由GGR三肽基序所替代，這是否影響PmCXCL8的趨化功能還有待深入研究。

圖6 純化后SDS-PAGE電泳和W estern blot分析Fig.6 SDS-PAGE and W estern blot analysis of protein purification

系統(tǒng)發(fā)生分析后發(fā)現(xiàn)，PmCXCL8與硬骨魚類聚為一總支，除與河七鰓鰻聚為一支外，未與任何其它魚類聚為一支，這一結(jié)果與其進(jìn)化地位相一致，七鰓鰻開始擁有原始的CXCL8，其與硬骨魚類CXCL8在序列上都較為相似，故有可能是從某一共同的基因進(jìn)化而來。七鰓鰻作為非脊椎動物與脊椎動物之間的過度物種，一直以來被認(rèn)為是活化石［14］，海七鰓鰻可以作為研究世界范圍內(nèi)七鰓鰻發(fā)育、免疫和進(jìn)化的良好模型，本研究結(jié)果也進(jìn)一步突顯出七鰓鰻在探究高度保守的先天性免疫的進(jìn)化中的重要作用。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)具有使用方便和成本低廉的優(yōu)點，研究水生動物基因功能時常用到該表達(dá)系統(tǒng)，2011年齊志濤等［23］研究報道了通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出非洲爪蟾干擾素-λ1基因的重組蛋白，2014年韋友傳等［24］研究報道了通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）MyD88的重組蛋白。2014年劉爽等［25］研究報道了通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出日本七鰓鰻IL-17的重組蛋白。但是，有些基因仍會出現(xiàn)表達(dá)困難或者表達(dá)的蛋白以不可溶的包涵體形式存在等問題。冷休克表達(dá)載體pCold系列應(yīng)用冷休克基因之一的cspA基因啟動子設(shè)計而成，可以有效表達(dá)蛋白，通過低溫誘導(dǎo)可明顯減慢細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)速率，降低二硫鍵錯誤折疊幾率，使目的蛋白獲得更好的可溶性表達(dá)［26-27］。2008年 劉 薇［28］研 究 報 道，使 用pCold載體可以有效提高小牛凝乳酶基因在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)。本研究結(jié)果顯示使用pColdI載體，可以在細(xì)菌培養(yǎng)的上清中發(fā)現(xiàn)PmCXCL8重組蛋白有較高的可溶性表達(dá)，為后續(xù)純化蛋白提供了很好的基礎(chǔ)。E.coli Rosetta（DE3）菌株含有 pRARE質(zhì)粒，能夠提供 AUA，AGG，AGA、CUA、CCC和 GGA稀有密碼子的tRNA，使得該宿主菌相對于其它大腸桿菌，提高了真核細(xì)胞蛋白的表達(dá)水平［29］。2009年尹春光等［30］研究報道，使用 E.coli Rosetta（DE3）菌株，可以提高人Mx基因重組蛋白的表達(dá)，有利于改善外源蛋白由于存在稀有密碼子低效表達(dá)的問題。本研究同時使用 E.coli BL21和 Rosetta（DE3）菌株進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 E.coli Rosetta（DE3）菌株中目的蛋白表達(dá)量明顯高于E.coli BL21菌株組，這進(jìn)一步為后續(xù)純化蛋白提供了良好的條件。

本研究首次在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)出海七鰓鰻的CXCL8蛋白，發(fā)現(xiàn)PmCXCL8與河七鰓鰻的CXCL8蛋白高度相似，相較于哺乳動物，其進(jìn)化地位與硬骨魚類更為接近，為七鰓鰻的天然免疫系統(tǒng)進(jìn)化研究奠定了基礎(chǔ)。同時使用了Bio-Rad IMAC蛋白質(zhì)純化試劑盒和Profinia蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)獲得較高純度的蛋白，為今后開展PmCXCL8功能研究提供了重要工具和手段。

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