PM2．5氧化應(yīng)激對(duì)變應(yīng)性哮喘氣道上皮固有免疫調(diào)控因子表達(dá)的刺激作用

鮑志堅(jiān) 胡旭 沈曉強(qiáng)

支氣管哮喘是一種由遺傳因素和環(huán)境因素綜合作用引起的，由肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等炎性細(xì)胞參與的炎性疾病[1]。其特點(diǎn)是氣道高反應(yīng)性和可逆性氣流受限，癥狀主要是反復(fù)發(fā)作的喘息、氣急、胸悶、咳嗽，多在夜間或清晨發(fā)作或加劇[2]。根據(jù)發(fā)病誘因一般將哮喘分為變應(yīng)性哮喘和非變應(yīng)性哮喘。變應(yīng)性哮喘由變應(yīng)原誘導(dǎo)，表現(xiàn)為嗜酸性粒細(xì)胞增多、肥大細(xì)胞和Ⅱ型輔助性T細(xì)胞激活、IL-4和IL-13等細(xì)胞因子大量分泌、免疫球蛋白E水平升高。非變應(yīng)性哮喘一般主要由大氣污染物（如粉塵顆粒、汽車尾氣等）、細(xì)菌或病毒感染及肥胖等環(huán)境因素刺激誘發(fā)，與變應(yīng)原的有無(wú)沒(méi)有直接關(guān)系[3-5]。近年來(lái)隨著環(huán)境污染的日益加重，空氣中PM2.5的含量已越來(lái)越受關(guān)注。國(guó)內(nèi)外大量研究顯示PM2.5超標(biāo)能顯著提高哮喘患者的發(fā)病率及發(fā)病次數(shù)[6-8]，但具體機(jī)制不明確。因此，本研究進(jìn)一步探討PM2.5所致的氧化應(yīng)激對(duì)變應(yīng)性哮喘氣道上皮固有免疫調(diào)控因子表達(dá)的刺激作用。

1 材料和方法

1.1 材料 健康清潔級(jí)BALB/c雌性小鼠24只，8～12周齡，體重約20～27g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。卵清蛋白購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：A5503；IL-4和IFN-γ的ELISA試劑盒購(gòu)自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為GWB-1230FC和AF-315-05-100；IL-5和IL-13的ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)ADL公司，貨號(hào)分別為L(zhǎng)E-07369和LE-06528。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型的制作 采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為哮喘模型組、PM2.5輕度污染組、PM2.5重度污染組和正常對(duì)照組4組，每組6只。（1）哮喘模型組：分別于第1、7和14天腹腔注射卵清蛋白致敏液200μl（致敏液采用50μg的卵清蛋白加入到200μl的磷酸鹽緩沖液內(nèi)溶解所成），于第21天起霧化吸入1%卵清蛋白溶液進(jìn)行激發(fā)，每次持續(xù) 30min，1次/d，連續(xù) 5d；（2）PM2.5輕度污染組：致敏方法同哮喘模型組，于第21天起吸入PM2.5（90μg/m3）和霧化的1%卵清蛋白溶液進(jìn)行激發(fā)；（3）PM2.5重度污染組：致敏和激發(fā)的方式同PM2.5輕度污染組，但吸入氣體內(nèi)PM2.5濃度為200μg/m3；（4）正常對(duì)照組：該組小鼠以不含卵清蛋白的飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，分別于第1、7和14天腹腔注射同等體積的磷酸鹽緩沖液，激發(fā)方法同哮喘模型組[9]。

1.2.2 小鼠血清免疫調(diào)控因子水平的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取小鼠血液10ml，靜置凝血后取血清，采用ELISA法檢測(cè)血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平。1.2.3 小鼠氣道及肺組織的病理學(xué)觀察 取出小鼠肺臟，灌入10%甲醛溶液，并置于相同溶液中固定，隨后進(jìn)行石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺內(nèi)結(jié)構(gòu)變化情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比較 哮喘模型組和正常對(duì)照組血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。PM2.5輕度污染組、PM2.5重度污染組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平均高于哮喘模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。PM2.5重度污染組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平均高于PM2.5輕度污染組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比較（pg/ml）

2.2 各組小鼠氣道及肺組織病理學(xué)表現(xiàn) 哮喘模型組小鼠氣道上皮明顯增厚，官腔出現(xiàn)不同程度的狹窄，管壁周圍的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)跡象明顯，呈一種典型的哮喘急性期發(fā)作的表現(xiàn)，見(jiàn)圖1。PM2.5輕度污染組小鼠氣道上皮增厚較哮喘模型組更顯著，官腔狹窄程度較模型組加重，部分氣道痙攣，肺泡腔內(nèi)分泌物增多，氣道管壁周圍及血管周圍均可見(jiàn)炎性反應(yīng)，見(jiàn)圖2。PM2.5重度污染組小鼠，可以觀察到廣泛的氣道痙攣、收縮或閉塞，氣道內(nèi)柱狀上皮顯著增厚，官腔明顯狹窄，氣道管壁周圍及肺組織內(nèi)可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖3。

3 討論

哮喘作為一種以氣道反應(yīng)增高為主要改變的疾病，其致病因素繁多。但當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究一致認(rèn)為：哮喘的起病可能是個(gè)體生長(zhǎng)環(huán)境及自身遺傳因素綜合作用的結(jié)果[10]。在哮喘發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程中，自身的免疫因素在其中起到了至關(guān)重要的作用，其典型的病理表現(xiàn)為氣道的反應(yīng)性增生、氣道周圍的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道分泌物增多以及機(jī)體的免疫調(diào)控因子釋放增加[11]。在哮喘的預(yù)防措施中，主要是通過(guò)避免個(gè)體與變應(yīng)原接觸，從而達(dá)到降低甚至控制哮喘的發(fā)生率的目的。

圖1 哮喘模型組小鼠肺組織病理切片（HE 染色，×400）

圖2 PM2.5輕度污染組小鼠肺組織病理切片（HE染色，×400）

圖3 PM2.5重度污染組小鼠肺組織病理切片（HE染色，×400）

本研究顯示哮喘模型組和正常對(duì)照組血清IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明造模成功后血清中各細(xì)胞調(diào)控因子間具有可比性。該研究結(jié)論與當(dāng)前大部分研究成果相一致。Chen等[12]通過(guò)對(duì)健康志愿者與哮喘患者（正常狀態(tài)下）的血清學(xué)指標(biāo)分析顯示，兩者血清學(xué)指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其認(rèn)為哮喘發(fā)作后體內(nèi)的大量免疫調(diào)控因子，可能是機(jī)體通過(guò)自身的變態(tài)反應(yīng)分泌的。因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)哮喘患者血清內(nèi)的免疫學(xué)指標(biāo)可在一定程度上評(píng)估哮喘患者病情的進(jìn)展程度。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著PM2.5濃度的升高，小鼠體內(nèi)的各種免疫調(diào)控因子均呈顯著地上升趨勢(shì)，且各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明PM2.5在一定程度上能夠誘發(fā)哮喘的發(fā)作，并加重哮喘病情的進(jìn)展。目前研究認(rèn)為PM2.5主要作用于非變應(yīng)性哮喘[13]，PM2.5增加非變應(yīng)性哮喘發(fā)病率的機(jī)制可能為PM2.5自身作為一種固體污染物，進(jìn)入人體后可以直接刺激相應(yīng)的呼吸道上皮，導(dǎo)致呼吸道上皮黏膜增厚，分泌物增加，因此誘導(dǎo)了哮喘的發(fā)生。然而本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)其對(duì)于變應(yīng)性哮喘同樣有增加發(fā)病率的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)研究認(rèn)為，PM2.5在空氣中并非只以固體顆粒物的形式存在，其自身就能吸附大量的致病菌或蛋白類物質(zhì)，因此當(dāng)這些物質(zhì)隨著PM2.5一起被吸入哮喘患者體內(nèi)之后，會(huì)快速地激發(fā)氣道內(nèi)自身的固有免疫系統(tǒng)，從而分泌大量的免疫調(diào)控物質(zhì)，以防止外來(lái)病原體通過(guò)氣道黏膜引起機(jī)體感染[14-15]。

雖然目前對(duì)PM2.5在變應(yīng)性哮喘患者中的作用尚無(wú)共識(shí)，但越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)其可誘發(fā)變應(yīng)性哮喘的發(fā)生。因此本研究認(rèn)為PM2.5可增加變應(yīng)性哮喘患者發(fā)病率的風(fēng)險(xiǎn)，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)氣道自身的固有免疫調(diào)控因子實(shí)現(xiàn)的，且PM2.5濃度越高，該效應(yīng)也越明顯。

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