中波紫外線誘導(dǎo)的提前衰老成纖維細(xì)胞中環(huán)狀RNA的表達(dá)及分析

司晨琛 周炳榮 駱丹

[摘要]目的：對于中波紫外線誘導(dǎo)的提前衰老的人類真皮成纖維細(xì)胞（UVB stress induced premature senescence，UVB-SIPS），筆者使用基因芯片篩選了其中環(huán)狀RNA的表達(dá)譜。方法：構(gòu)建UVB-SIPS模型；采用β-gal染色、細(xì)胞周期、CCK8（cell counting kit）檢測衰老成纖維細(xì)胞；基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)的環(huán)狀RNA；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗證相關(guān)環(huán)狀RNA；利用Clusterprofiler r package，對上下調(diào)基因分別進(jìn)行KEGG和GO的富集分析。結(jié)果：與對照組比較（差異表達(dá)倍數(shù)≥1.5，P<0.05），共有472個差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，其中228個環(huán)狀RNA上調(diào)，244個環(huán)狀RNA下調(diào)。在472個差異表達(dá)的環(huán)狀RNA中隨機(jī)選擇了8個環(huán)狀RNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。其中有5個環(huán)狀RNA（hsa_circRNA_100797，hsa_circRNA_100686，hsa_circRNA_400036，hsa_circRNA_101755，hsa_circRNA_003794）與基因芯片的結(jié)果一致。GO分析顯示，UVB-SIPS組細(xì)胞中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA親本基因與細(xì)胞對紫外線輻射的反應(yīng)、DNA修復(fù)復(fù)合物、有絲分裂、微管蛋白結(jié)合等注釋條目有關(guān)；KEGG分析顯示，UVB-SIPS組細(xì)胞與未處理組細(xì)胞相比，差異表達(dá)的環(huán)狀RNA的親本基因可能參與與衰老相關(guān)的細(xì)胞周期、p53信號通路、PPAR信號通路等的調(diào)節(jié)。結(jié)論：本研究初步揭示了提前衰老的人類真皮成纖維細(xì)胞中環(huán)狀RNA的表達(dá)，可為未來研究光老化發(fā)生機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]提前衰老成纖維細(xì)胞；環(huán)狀RNA；基因芯片；競爭結(jié)合；生信分析；中波紫外線

[中圖分類號]R329.2 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）12-0128-04

The Expression and Analysis of Circular RNA in Fibroblasts Induced by Ultraviolet B

SI Chen-chen，ZHOU Bing-rong，LUO Dan

（Department of Dermatology， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，Jiangsu，China）

Abstract： Objective CircRNAs expression profiling was screened in human fibroblasts （HFs） with gene chip in our study. Methods The senescence of cells was verified by β-gal staining， cell cycle and CCK8 （cell counting kit）. The differently expressed circRNA ware screened by gene chip.Some circRNAs were tested by qRT-PCR （real-time quantitative polymerase chain reaction） randomly. The Clusterprofiler r package was used to analyse GO and KEGG pathway of up-regulated and down-regulated circRNAs. Results Compared to the control group （fold change ≥1.5，P<0.05）， a total of 472 circRNAs in the UVB-SIPS group were differently expressed. Among them， 228 circRNAs were up-regulated and the other 244 down-regulated. The microarrays of eight circRNAs selected from the 472 differently expressed circRNAs were retested by qRT-PCR. The results of five （hsa_circRNA_100797， hsa_circRNA_100686， hsa_circRNA_400036， hsa_circRNA_101755， hsa_circRNA_003794） were in accordance with their chip results. Go analysis showed that the parent genes of differently expressed circRNA in UVB-SIPS group were related to the annotataion of cellular response to UV， DNA repair complex， mitotic nuclear division， tubulin protein binding and so on. KEGG analysis implicated the parent genes of differently expressed circRNA in UVB-SIPS group may be involved in regulating the pathway of cell cycle， p53 signal pathway， PPAR signal pathway when compared to blank group. Conclusion This study uncovered the profiling of circRNA in premature senescent human fibroblasts for the first time and lay the foundation for studying the mechanism of photoaging.

Key words： premature senescent fibroblasts； circular RNA； microarray； competitive binding；bioinformatic analysis； ultraviolet B

皮膚衰老由內(nèi)源性衰老和外源性衰老引起，內(nèi)源性衰老主要指人體的自然衰老，外源性衰老也叫光老化，主要由太陽光照射引起。一些刺激，例如紫外線照射，可引起體外正常細(xì)胞提前衰老。人成纖維細(xì)胞（human fibroblasts， HFs）能分泌膠原纖維、彈力纖維和一些能促進(jìn)表皮細(xì)胞生長和遷移的生長因子[1]。環(huán)狀RNA首先于1976年在植物病毒中被發(fā)現(xiàn)，一開始它被認(rèn)為是一類錯誤剪接且沒有研究意義的RNA。其實環(huán)狀RNA是一類不受核酸外切酶影響，在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定、豐富存在，5'末端和3'末端剪接在一起的非編碼RNA[2]。近年來發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA能調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和RNA結(jié)合蛋白的翻譯[3]。此外，環(huán)狀RNA因能互補(bǔ)結(jié)合miRNA進(jìn)而調(diào)節(jié)靶向mRNA的作用已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[4-5]。目前已存在一些環(huán)狀RNA與衰老相關(guān)的前期研究[6-7]，但環(huán)狀RNA在人類衰老的皮膚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)還未得到研究。因此，本研究主要對UVB誘導(dǎo)的人提前衰老的真皮成纖維細(xì)胞中環(huán)狀RNA的表達(dá)及潛在功能進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 材料：人類成纖維細(xì)胞取自江蘇省人民醫(yī)院泌尿外科門診健康男性患者的包皮。該研究已通過南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的倫理審核且所有受試者均簽署了知情同意書。胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)液分別購于美國Amresco公司和美國Gibco公司。胎牛血清購于杭州四季青生物公司。β-gal衰老染色試劑盒和CCK8試劑盒分別購于江蘇碧云天公司和美國Bimake公司。Trizol核酸提取液購于美國Invitrogen公司。UVB照射儀購于上海希格瑪高技術(shù)有限公司（ss-40，波長280～320?m，波峰311nm）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：將包皮放在碘伏中浸泡10min后用含有青霉素、鏈霉素的PBS反復(fù)沖洗3次。分離出包皮的皮下組織，浸泡在含1%青霉素、鏈霉素的PBS中沖洗。加入適量0.5% Dispase酶消化液，將裝有包皮的培養(yǎng)皿放入4℃冰箱中消化18～20h。取出后將表皮與真皮分離，棄去表皮，真皮部分加入0.1%膠原酶I消化液，放入37℃、含5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2h，取出后加入含10%胎牛血清及1%青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，用槍頭輕輕反復(fù)吹打后使用200目尼龍網(wǎng)過濾；得濾液并將細(xì)胞懸液在1 500r/min離心5min，棄去細(xì)胞上清液，加入培養(yǎng)液后吹打混勻，放入37℃、含5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置，等待細(xì)胞貼壁。

1.2.2 UVB-SIPS模型的體外構(gòu)建：空白對照組：不做任何處理的成纖維細(xì)胞；UVB-SIPS組：直接接受UVB照射的成纖維細(xì)胞。在UVB-SIPS組中，根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果來設(shè)定UVB的累計照射劑量。UVB的照射方法參考Xu Y等[8]的研究進(jìn)行。UVB照射前，去除細(xì)胞的培養(yǎng)基并換成PBS。通過Waldmann UV meter來檢測UVB機(jī)器發(fā)射劑量的大小。UVB的劑量=UVB的照射強(qiáng)度（mJ）×照射時間（s）。細(xì)胞與紫外燈的距離應(yīng)保持15cm。UVB-SIPS組的細(xì)胞接受每天10mJ/cm2，共計5d的UVB照射。照射后靜置48h，UVB-SIPS的模型即可建立并用于下一步的研究。

1.2.3 細(xì)胞衰老染色：β半乳糖苷酶染色試劑盒可用于檢測細(xì)胞衰老。操作步驟如下：將細(xì)胞固定在2%或者0.2%戊二醛中，15min后用PBS洗凈。再將細(xì)胞放入配置好的工作液中，于37℃、不含CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)后，在普通光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞增殖率測定：將UVB-SIPS細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素、的DMEM培養(yǎng)液中稀釋成密度為每微升500個細(xì)胞，然后以每孔4?l共2 000個細(xì)胞接種至96孔板內(nèi)，24h后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。去除原始培養(yǎng)液，每孔加入10?l CCK8溶液和90?l DMEM培養(yǎng)液。在含5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中孵育1h，在450nm吸光度下用酶標(biāo)儀檢測OD值。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測：在最后1次UVB照射3d后，用0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞被消化下來時加入培養(yǎng)液，用離心機(jī)進(jìn)行1 500r，5min的離心。去除上清液，用1ml冰PBS重懸細(xì)胞。向-20℃ 3ml無水乙醇中緩慢滴入重懸的細(xì)胞，輕輕吹勻。用流式檢測儀進(jìn)行檢測。

1.2.6 RNA提取、準(zhǔn)備及芯片技術(shù)：用于提取和純化總RNA的試劑分別是：Trizol試劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）和MirVana miRNA分離試劑盒（Ambion，Austin，TX，USA），瓊脂糖凝膠電泳用于檢測RNA的完整性。使用基因芯片技術(shù)進(jìn)行檢測。

1.2.7 生信分析：利用Clusterprofiler r package，物種選擇為人類，對上下調(diào)基因分別進(jìn)行KEGG和GO的富集分析。將P<0.05設(shè)置為篩選條件，按照P值，由小到大進(jìn)行篩選。

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)分析：使用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測數(shù)據(jù)均以（x?±s）表示，采用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 衰老成纖維細(xì)胞的驗證：UVB-SIPS組β-gal染色陽性率為（28.6±0.031）%，而對照組陽性率是（10.5±0.021）%。兩組比較，差異有有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；細(xì)胞周期顯示：UVB組細(xì)胞與對照組相比，G1期明顯受阻滯，S期減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（對照組G1期：48%，UVB組G1期：55%，P<0.05）；UVB-SIPS組細(xì)胞CCK8檢測的OD值為（0.891±0.097），與空白對照組（OD值1.200±0.123）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.82，P<0.05），說明UVB-SIPS組的細(xì)胞增殖活力低于對照組。細(xì)胞驗證結(jié)果見圖1。

2.2 UVB-SIPS組中環(huán)狀RNA表達(dá)譜：基因芯片檢測并篩選出782個差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，其中有472個與對照組相比差異表達(dá)倍數(shù)FC≥1.5， P<0.05。在這些環(huán)狀RNA中，228個上調(diào)，244個下調(diào)。上調(diào)最顯著的是hsa_circRNA_101266，差異表達(dá)倍數(shù)FC=7.0704， P=0.00057；最顯著下調(diào)的是hsa_circRNA_089761，差異表達(dá)倍數(shù)FC=14.81， P=0.00778。層次聚類圖、火山圖和散點(diǎn)圖都定性揭示了UVB-SIPS組中環(huán)狀RNA的差異表達(dá)情況。見圖2。

2.3 差異表達(dá)的環(huán)狀RNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：在芯片篩選出的差異表達(dá)的環(huán)狀RNA中，隨機(jī)選擇8個差異表達(dá)的環(huán)狀RNA進(jìn)行實時定量PCR。PCR結(jié)果顯示hsa_circRNA_400036，hsa_circRNA_101755， hsa_circRNA_003794在UVB-SIPS中上調(diào)，hsa_circRNA_100797， hsa-circRNA_100686在UVB-SIPS中下調(diào)。然而，hsa_circRNA_101911和hsa_circRNA_102442的PCR結(jié)果與芯片結(jié)果不符合。hsa_circRNA_003781的差異表達(dá)量無意義。見圖3。

2.4 生信分析：GO分析顯示，UVB-SIPS組細(xì)胞與未處理組細(xì)胞相比，上調(diào)的環(huán)狀RNA的親本基因主要與細(xì)胞對輻射的反應(yīng)、DNA損傷復(fù)合物、泛素蛋白連接酶等富集條目有關(guān)；下調(diào)的環(huán)狀RNA的親本基因在有絲分裂、DNA組裝復(fù)合體、微管蛋白結(jié)合等方面可能有一定作用。KEGG分析顯示，UVB-SIPS組細(xì)胞與未處理組細(xì)胞相比，差異表達(dá)的環(huán)狀RNA的親本基因參與與衰老相關(guān)的細(xì)胞周期、p53信號通路、PPAR信號通路等的調(diào)節(jié)。

3 討論

環(huán)狀RNA是一種非編碼RNA且在真核生物轉(zhuǎn)錄組中占總RNA95%的非常重要的基因調(diào)控者。環(huán)狀RNA由mRNA在5 '末端和3'末端剪接后連接而成。環(huán)狀RNA除了可充當(dāng)miRNA海綿外，還可以通過參與基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯來調(diào)節(jié)miRNA功能[9]。筆者研究首次揭示了UVB-SIPS中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA的表達(dá)譜。通過基因芯片篩選出的差異表達(dá)的環(huán)狀RNA，隨機(jī)選擇了8個進(jìn)行實時定量PCR驗證它們的差異性。其中，5個環(huán)狀RNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果顯示與基因芯片一致。許多基因的表達(dá)受到溫度、試驗方法、樣品提取時間的影響，另外芯片的結(jié)果與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比較準(zhǔn)確性相對較低。劉騰飛[10]的研究發(fā)現(xiàn)在衰老的擬南芥葉子中，環(huán)狀RNA是上調(diào)的。而另一篇文獻(xiàn)[2]發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA在老化的小鼠腦組織中也是上調(diào)的。在我們的研究中，總共檢測出782個環(huán)狀RNA，包括228個上調(diào)及244個下調(diào)的環(huán)狀RNA。但是，在隨機(jī)篩選的并通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗證的8個環(huán)狀RNA中，3個下調(diào)而4個上調(diào)。大多數(shù)與衰老有關(guān)的環(huán)狀RNA總體呈上調(diào)趨勢。我們猜測可能由于衰老的組織中，環(huán)狀RNA有積聚傾向，進(jìn)而導(dǎo)致其在組織中上調(diào)。芯片結(jié)果中上調(diào)最明顯的環(huán)狀RNA是hsa_circRNA_101266，與正常細(xì)胞相比的差異倍數(shù)是7.07；下調(diào)最明顯的環(huán)狀RNA是hsa_circRNA_089761，與正常細(xì)胞相比的差異倍數(shù)是14.81。UVB-SIPS芯片檢測的環(huán)狀RNA的差異表達(dá)倍數(shù)并不像癌癥[11]中那么明顯，可能因為癌癥是一種病理過程并受到藥物刺激的影響，而由于UVB照射引起的皮膚衰老是一種柔和的慢性生理過程。

GO分析和KEGG分析提示UVB-SIPS組細(xì)胞在細(xì)胞生物過程、細(xì)胞組分和分子功能方面更具衰老傾向。GO分析顯示，UVB-SIPS組細(xì)胞與未處理組細(xì)胞相比，上調(diào)環(huán)狀RNA的親本基因主要與細(xì)胞對紫外線輻射的反應(yīng)、DNA雙鏈松解、泛素蛋白連接酶、氧化還原酶活性等和細(xì)胞老化相關(guān)的注釋條目有關(guān)；同樣的，下調(diào)的環(huán)狀RNA的親本基因與有絲分裂、DNA組裝復(fù)合體、核糖體亞基組成、轉(zhuǎn)化生長因子β等影響細(xì)胞增殖的注釋條目相關(guān)。KEGG分析顯示，UVB-SIPS組細(xì)胞與未處理組細(xì)胞相比，差異表達(dá)的環(huán)狀RNA的親本基因參與和衰老相關(guān)的細(xì)胞周期、p53信號通路、PPAR信號通路等的調(diào)節(jié)。

綜上所述，本研究揭示了人類UVB-SIPS中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA的一個總體表達(dá)水平。它們對皮膚成纖維細(xì)胞衰老的調(diào)節(jié)作用值得進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2018-07-30 [修回日期]2018-09-10

編輯/賈敏