三種不同波長(zhǎng)激光照射對(duì)體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)水平的影響

肖杰華 冶娟

[摘要]目的：對(duì)體外培養(yǎng)的小鼠成纖維細(xì)胞分別使用3種不同波長(zhǎng)（595nm、755nm、1 064nm）的激光照射，觀察分析不同波長(zhǎng)激光照射對(duì)成纖維細(xì)胞中I型、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)水平的影響。方法：采用體外培養(yǎng)新生小鼠成纖維細(xì)胞，根據(jù)激光照射的波長(zhǎng)不同通將其分為對(duì)照組6只（不采用激光照射），595nm組6只（采用波長(zhǎng)為595nm激光照射），755nm組6只（采用波長(zhǎng)為755nm激光照射）及1 064nm組6只（采用波長(zhǎng)為1 064nm激光照射）。通過(guò)熒光定量（RT-PCR）法測(cè)定成纖維細(xì)胞I型、Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果：4組間Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)水平間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中1 064nm組的Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最高，分別為（113.07±2.85）×10-2、（118.72±1.96）×10-2，均顯著高于595nm組的[（96.74±1.03）×10-2、（101.51±1.64）×10-2，P<0.01]，755nm組的[（100.02±1.86）×10-2、（109.27±1.02）×10-2，P<0.01]，及對(duì)照組的[（87.14±0.82）×10-2、（100.48±0.73）×10-2，P<0.01]；755nm組Ⅰ型前膠原mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P<0.01），而其Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)水平則顯著高于595nm組和對(duì)照組（P<0.01）；595nm組僅有Ⅰ型前膠原表達(dá)水平mRNA顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。結(jié)論：激光照射可以誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中I型、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)增加。其中，波長(zhǎng)為595nm的激光照射僅能促進(jìn)I型前膠原mRNA表達(dá)上調(diào)，755nm激光照射后Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)上調(diào)明顯高于595nm激光，而1 064nm激光照射后兩種前膠原mRNA表達(dá)水平最高。

[關(guān)鍵詞]激光；小鼠成纖維細(xì)胞；前膠原I型；前膠原Ⅲ型；mRNA；皮膚老化

[中圖分類號(hào)]R329 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2018）12-0125-04

Effects of Three Wavelength Laser Irradiation on the Expression of Procollagen Type Ⅰ and Ⅲ Procollagen mRNA in Cultured Fibroblasts

XIAO Jie-hua1，YE Juan2

（1.Qinghai Health Vocational and Technical College，Xining 810000，Qinghai，China；2. Medical Beauty Center，Affiliated Hospital of Qinghai University，Xining 810000，Qinghai，China）

Abstract： Objective In vitro cultured mouse fibroblasts were irradiated with 3 different wavelengths （595/755/1 064nm）， and the effects of laser irradiation at different wavelengths on the expression of two types of procollagen （type I， type Ⅲ） in fibroblasts were observed and analyzed. Methods Neonatal mouse fibroblasts were cultured in vitro. According to the wavelength of laser irradiation， it was divided into 6 cases in control group， 6 cases in 595nm group with laser irradiation at 595nm， 6 cases in 755nm group with laser irradiation at 755nm and 6 cases in 1 064nm group laser irradiation at 1064nm. The expression of type I and type Ⅲ procollagen mRNA in fibroblasts was determined by RT-PCR. Results There were significant differences in the expression of procollagen mRNA among the four groups （P<0.05）， and the relative expression of procollagen mRNA in 1 064nm group was the highest[ （113.07±2.85）×10-2，（118.72±1.96）×10-2，P<0.01]，respectively. It was significantly higher than those in 595nm group [（96.74±1.03）×10-2，（101.51±1.64）×10-2，P<0.01]，than those in 755nm group [（100.02±1.86）×10-2， （109.27±1.02）×10-2，P<0.01]. In the control group [（87.14±0.82） ×10-2，（100.48±0.73）×10-2，P<0.01]. The relative expression of typeⅠprocollagen mRNA in group B was significantly higher than that in control group （P<0.01）， and the expression level of type Ⅲ procollagen mRNA in 755nm group was significantly higher than that in 595nm group and control group （P<0.01）， but only typeⅠprocollagen mRNA in 595nm group was significantly higher than that in control group （P<0.01）. Conclusion Laser irradiation can induce two precollagen （typeⅠ， type Ⅲ） mRNA expression in fibroblasts. The laser irradiation with a wavelength of 595nm can only promote the up regulation of mRNA expression of type I procollagen， and the up regulation of mRNA expression of type Ⅲ procollagen mRNA after 755nm laser irradiation is significantly higher than that of 595nm laser， while the highest expression level of two procollagen mRNA was observed after 1 064nm laser irradiation.

Key words： laser； mouse fibroblasts； procollagen type I； procollagen type Ⅲ； mRNA； skin aging

膠原蛋白是皮膚真皮的重要組成部分，隨著年齡增長(zhǎng)，其在人體內(nèi)的含量也會(huì)隨之減少。因此，膠原蛋白也被臨床作為評(píng)估皮膚衰老的重要指標(biāo)[1]。成纖維細(xì)胞是合成分泌膠原蛋白的主要細(xì)胞，當(dāng)皮膚成纖維細(xì)胞老化后，其活性下降，分泌的膠原蛋白也隨之減少，進(jìn)而加速了皮膚老化[2-3]。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究[4-5]曾表明：非剝脫性激光照射可以加速成纖維細(xì)胞的增殖分化。且激光治療的嫩膚效果明顯，已被廣泛應(yīng)用于皮膚美容中。基于此，本文使用了3種不同波長(zhǎng)的激光照射成纖維細(xì)胞，進(jìn)一步研究討論不同激光作用下，I型和Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)水平是否存在差異，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和儀器：選取出生2個(gè)月的健康昆明小鼠，均為雌性，體重（34±2）g，由廣州市賽柏諾生物科技有限公司提供。倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；595nm脈沖染料激光（PDL），購(gòu)自美國(guó)賽諾秀公司；755nm翠綠寶石激光（GentleLase），Q開(kāi)關(guān)1 064nm激光（ND：YAG），755nm、1 064nm激光儀均購(gòu)自美國(guó)Candela公司；PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；TM 2 200凝膠成像系統(tǒng)（Alphaimager），購(gòu)自北京博嘉興業(yè)科技有限公司；提取總RNA的Trizol試劑購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；熒光定量PCR試劑盒來(lái)自美國(guó)Pepro Tech 公司。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 體外成纖維細(xì)胞培養(yǎng)及分組：根據(jù)參考文獻(xiàn)的[6]方法收集小鼠皮膚，向DEME培養(yǎng)基內(nèi)接種成纖維細(xì)胞，放置于培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)條件：5% CO2、37℃、95%飽和濕度。通過(guò)倒置顯微鏡觀察到纖維母細(xì)胞邊界清楚、呈梭形或多角形胞體，均為貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到相互融合狀態(tài)后，進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)，并將細(xì)胞接種于玻璃培養(yǎng)皿中。單個(gè)樣本：以1ml第2代細(xì)胞懸液5×106細(xì)胞/ml接種于新的培養(yǎng)皿中為準(zhǔn)，根據(jù)激光照射的波長(zhǎng)不同通將所有樣本分為對(duì)照組6只，不給予激光照射；595nm組6只，采用波長(zhǎng)為595nm的激光照射，脈寬3ms，光斑直徑為7mm，能量密度保持為10J/cm2；755nm組6只，采用波長(zhǎng)為755nm的激光照射，脈寬及能量密度同595nm組，光斑直徑為10mm；1 064nm組6只，采用波長(zhǎng)為1 064nm的激光照射，脈寬10ms，光斑直徑為3mm，能量密度保持為2.5J/cm2。激光分10個(gè)區(qū)域垂直照射玻璃培養(yǎng)蓋，非重疊全覆蓋照射，每天1次，連續(xù)照射3d。激光照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)10h。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)：采用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒操作，加入Ⅰ、Ⅲ型前膠原上、下游引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳條帶圖像，以β-actin為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算I型、Ⅲ型前膠原電泳條帶密度/β-actin比值，即膠原的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用軟件SPSS 22.0處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用（x?±s）表示，組間比較行F檢驗(yàn)，兩兩比較行配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組Ⅰ型前膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量比較：4組間Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與對(duì)照組相比，595nm組、755nm組、1 064nm組Ⅰ型前膠原mRNA的表達(dá)水平明顯更高（P<0.01）；其中1 064nm組的mRNA的表達(dá)水平最高，明顯高于595nm組、755nm組（P<0.01），而595nm組、755nm組mRNA的表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1，圖1。

2.2 各組Ⅲ型前膠原mRNA相對(duì)表達(dá)量比較：4組間Ⅲ型前膠原mRNA的表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中，1 064nm組的mRNA表達(dá)水平最高，明顯高于595nm組、755nm組和對(duì)照組（P<0.01），而755nm組mRNA的表達(dá)水平則顯著高于595nm組和對(duì)照組（P<0.01），但595nm組mRNA的表達(dá)水平與對(duì)照比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2，圖2。

3 討論

隨著年齡增加，皮膚衰老明顯，表現(xiàn)為：松弛、彈性下降等，而這些均是由成纖維細(xì)胞失去活性，合成分泌功能減弱有關(guān)。成纖維細(xì)胞是皮膚真皮的重要組成部分，研究表明：其合成分泌的膠原蛋白，是維持皮膚彈性，修復(fù)皮膚創(chuàng)傷的基礎(chǔ)[7-8]。因此，增強(qiáng)成纖維細(xì)胞活性，促進(jìn)膠原含量的合成分泌，是抗皮膚衰老的關(guān)鍵[9]。CO2激光是早期剝除式的嫩膚美容技術(shù)，雖然能夠有效促進(jìn)真皮及表皮的再生，但術(shù)后易出現(xiàn)瘢痕等并發(fā)癥[10]。而非剝除式激光嫩膚技術(shù)出現(xiàn)，正好彌補(bǔ)了這一缺陷，在阻止真皮層受損的同時(shí)，還能達(dá)到促進(jìn)膠原再生的目的，且術(shù)后并發(fā)癥少，已被廣泛應(yīng)用于皮膚美容中[11]。目前常用的非剝除式嫩膚的光源有ND：YAG及脈沖染料激光等，其作用的理論基礎(chǔ)為國(guó)外學(xué)者提出的光熱解理論[12]。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究也已經(jīng)證實(shí)非剝除式嫩膚具有治療色素沉著、延緩皮膚衰老等作用[13-15]。但關(guān)于不同激光技術(shù)對(duì)于成纖維細(xì)胞中膠原蛋白影響的研究還較少。因此，本研究分別選用了3種不同波長(zhǎng)的激光照射成纖維細(xì)胞，分析討論其中膠原mRNA的變化。

國(guó)內(nèi)Dang[16]研究報(bào)道稱：595nm激光治療可使膠原纖維含量增加，尤其是Ⅰ型前膠原。本研究結(jié)果也顯示：與對(duì)照組相比，595nm I型前膠原mRNA明顯增加（P<0.05），但595nm與對(duì)照組間的Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示：595nm激光可促進(jìn)I型膠原的合成，而對(duì)Ⅲ型膠原的的影響則較小。原因可能為：該類脈沖染料激光可以穿透真皮，被血管中的血色素吸收，促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放，并激活成纖維細(xì)胞，合成新的膠原蛋白。國(guó)內(nèi)Dang等[17]對(duì)昆明小鼠的研究表明：1 064nm激光照射組小鼠皮膚中膠原蛋白較595nm激光照射組明顯增加。本研究結(jié)果也證實(shí)1 064nm的I型和Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)均高于595nm組、755nm組及對(duì)照組。而劉華緒[18]對(duì)昆明小鼠的的研究也證實(shí)了：1 064nm激光照射下，非磨削膠原重組效果優(yōu)于595nm組。提示：激光刺激下，成纖維細(xì)胞的膠原含量均有所增加，且波長(zhǎng)越長(zhǎng)，誘導(dǎo)合的膠原也隨之增多。國(guó)內(nèi)研究[19-20]中多采用755nm翠綠寶石激光進(jìn)行脫毛或治療的色素性皮膚病。而關(guān)于其對(duì)膠原影響的研究較少。本研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組及595nm組相比，755nm組的Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，但其與595nm組I型膠原蛋白表達(dá)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；提示：755nm翠綠寶石激光也能刺激成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白，尤其是Ⅲ型前膠原。

綜上所述，3種激光均能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成分泌更多的Ⅰ、Ⅲ型前膠原，且1 064nm激光促進(jìn)膠原合成的效果最好，但本研究尚存在不足指出，如研究范圍較小，未分析激光使用周期、炎癥反應(yīng)等因素的影響等，需進(jìn)一步行大樣本研究。

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[收稿日期]2018-06-25 [修回日期]2018-08-15

編輯/朱婉蓉