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    植物乳桿菌P9對頭孢曲松鈉作用小鼠腸道菌群的影響

    2022-05-01 09:08:16陳苗苗李可文熊雪梅吳夢琦劉小溪鄭秋生
    食品研究與開發(fā) 2022年8期
    關(guān)鍵詞:頭孢曲松灌胃菌群

    陳苗苗,李可文,熊雪梅,吳夢琦,劉小溪,鄭秋生*

    (1.石河子大學(xué)藥學(xué)院,新疆 石河子 832000;2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150030;3.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院,北京 100023)

    腸道菌群是寄居在人或動物腸道內(nèi)的正常微生物,這些微生物種類繁多且數(shù)量龐大,不同菌種之間相互制約又相互依存,形成了一種動態(tài)平衡。隨著人類微生物組項目以及腸道宏基因組學(xué)的發(fā)展,腸道菌群被認為是一種新的多細胞“器官”,是維持宿主各種生命活動平衡的重要因素[1],具有參與營養(yǎng)和代謝、抗菌保護、維持腸道黏膜的完整性、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等功能[2]。腸道菌群可以激活腸道免疫系統(tǒng),在腸道屏障功能中發(fā)揮重要作用,同時還可以利用多種天然多糖,將其轉(zhuǎn)化為有益的代謝物,維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)的平衡[3]。然而,當(dāng)宿主或外界環(huán)境發(fā)生變化,尤其是濫用抗生素時,會導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)[4],使腸道內(nèi)益生菌的豐度降低,干擾有益代謝物的轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn),腸道菌群失調(diào)與消化系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等一系列疾病有著密切的相關(guān)性[5],因此對腸道菌群失調(diào)的調(diào)節(jié)可能降低這些系統(tǒng)疾病的發(fā)生率,對維持機體健康有著重要意義。

    益生菌是一種食用后對宿主健康有益的活性微生物,能夠通過改變微生物群的組成或活性的方式產(chǎn)生促進健康作用[6]。植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)是廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境中的一種益生菌,它具有高度的耐酸性,在發(fā)酵后期占據(jù)主要地位,被廣泛應(yīng)用于食品和健康行業(yè)[7]。研究發(fā)現(xiàn)L.plantarum的基因組可以根據(jù)生態(tài)位的需要,獲取、組裝、替換或刪除利用碳水化合物的基因盒,因此又被稱為“天然代謝工程師”[8],具有預(yù)防和治療炎癥性腸病、冠心病、腸易激綜合征,以及調(diào)節(jié)糞便菌群組成等功能[9-10]。植物乳桿菌P9是由Li等[11]從自然發(fā)酵酸粥中分離出來的一株菌株,研究顯示它具有降解有機磷農(nóng)藥的作用,而且其在胃腸液和膽汁中有很強的耐受性,因此可能對腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用。

    抗生素是一類由生物、微生物在生命活動過程中產(chǎn)生的具有抗病原體、干擾細胞生長發(fā)育的化學(xué)物質(zhì),但在使用過程中容易產(chǎn)生抗生素濫用,從而導(dǎo)致菌群失調(diào)、二重感染、超級細菌產(chǎn)生等危害機體健康的情況。在腸道中,抗生素通過改變細菌代謝產(chǎn)物和腸道微環(huán)境,從而影響腸道固有免疫功能,降低宿主腸道菌群的定植能力[12],導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)。目前選用頭孢曲松鈉建立菌群失調(diào)模型的方法被大多數(shù)研究所采用[3],本研究主要通過灌胃頭孢曲松鈉的方式建立小鼠腸道菌群失調(diào)模型,探究L.plantarum P9對小鼠腸道菌群的影響,為益生菌制劑的研制與開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物

    60只健康雄性balb/c小鼠(4周齡,體重18g~20g):北京華阜康生物科技股份有限公司,許可證號為SYXK(京)2017-0038。所有動物飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院SPF級動物實驗中心,給予每天12 h光照/黑暗交替條件,室內(nèi)溫度為(20±2)℃,相對濕度為45%~60%。本次動物研究實驗設(shè)計及實驗方案通過了北京聯(lián)合大學(xué)倫理委員會審核和批準(zhǔn),倫理委員會意見書編號:20210601。

    1.1.2 試劑

    植物乳桿菌P9菌粉(活菌數(shù)≥2.0×1011CFU/g):北京鴻測科技開發(fā)股份有限公司;頭孢曲松鈉(純度≥98%):上海阿拉丁公司;白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)試劑盒、白介素-2(interleukin-2,IL-2)試劑盒、白介素-6(interleukin-6,IL-6)試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒:武漢華美公司;總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒、谷胱甘肽(glutathione,GSH)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)試劑盒:南京建成生物工程研究所;伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基、疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基、雙歧桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基、乳酸桿菌選擇性瓊脂培養(yǎng)基:北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司;膠回收試劑盒(qiagen aquick gel extraction kit):德國凱杰生物技術(shù)有限公司;DNA純化試劑盒(gene JETTM gel extraction kit):日本賽默飛世爾科技公司;DNA 建庫試劑盒(TruSeq DNA PCR-Free):美國因美納公司;無水乙醇、二甲苯、中性樹膠:國藥集團化學(xué)試劑有限公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色液套裝:武漢賽維爾生物科技有限公司。

    1.2 儀器設(shè)備

    TECAN酶標(biāo)儀(Inifinite M NANO):廣州深華公司;低溫超速離心機(Centrifuge 5702 RH):德國艾本德有限公司;實驗室超純水機(Mili-Q EQ 7000):美國密理博公司;紫外可見分光光度計(UV-4802):尤尼柯儀器有限公司;電子分析天平(CPA225D):德國賽多利斯公司;漩渦振蕩儀(Hula Dancer basic):德國艾卡公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 動物分組及給藥

    60只小鼠在SPF級動物實驗室適應(yīng)性喂養(yǎng)一周,溫度為18℃~22℃,濕度為45%~60%,自由飲食和飲水。1周后,隨機取48只小鼠,每只小鼠灌胃0.2 mL頭孢曲松鈉(200 mg/mL),1次/d,連續(xù) 5 d,建立小鼠腸道菌群失調(diào)模型。然后將這48只小鼠隨機分為4組,每組12只,分別為模型組和低、中、高3個劑量組,L.plantarum P9配方推薦劑量為2×109CFU/60 kg,本實驗采用等效換算的方法,分別以人體推薦劑量的5倍、10倍、30倍為3個劑量組,即低劑量組(L.plantarum P9 1×108CFU/kg)、中劑量組(L.plantarum P9 2×108CFU/kg)、高劑量組(L.plantarum P9 6×108CFU/kg)灌胃給藥,對照組和模型組灌胃生理鹽水,連續(xù)23 d。每天同一時間測小鼠體重,并記錄小鼠的狀態(tài)、攝食情況等。

    1.3.2 樣品采集

    L.plantarum P9灌胃23 d后,采集小鼠無菌糞便用于活菌計數(shù)和16S rDNA測序。小鼠摘眼球取血,置于1.5 mL離心管中,4℃靜置15 min,4 000 r/min離心15 min,吸取上清液,分裝后于-80℃儲存?zhèn)溆?。將小鼠麻醉后斷頸處死,解剖出心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺用離心管分裝好,置于冰中備用。小腸用生理鹽水沖洗,進行稱重并測量小腸長度,將空腸放入組織固定液中,按順序編號,留作病理切片。

    1.3.3 臟器系數(shù)測定

    將解剖出的各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺分別進行稱重,按以下公式計算臟器系數(shù)。

    臟器系數(shù)/%=小鼠臟器質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100

    1.3.4 血清炎癥因子測定

    采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)分別測定小鼠血清中白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素 2(IL-2)、白細胞介素 6(IL-6)等炎癥因子的含量,以及腫瘤壞死因子(TNF-α)的水平,操作步驟依據(jù)相應(yīng)試劑盒說明書進行。

    1.3.5 肝臟及腸道抗氧化指標(biāo)測定

    取每只小鼠相同位置的肝臟和小腸組織,以1∶9的質(zhì)量比加入生理鹽水,冰浴下勻漿,再于4℃、4000r/min離心15min后取上清液,分裝后放置于-80℃凍存,用于抗氧化指標(biāo)測定??寡趸笜?biāo)包括T-SOD、MDA、GSH以及GSH-Px。測定方法按照相應(yīng)的試劑盒說明書進行。

    1.3.6 小腸病理切片形態(tài)學(xué)觀察

    將選取的空腸組織用石蠟包埋,用切片機切片。石蠟切片依次用二甲苯、無水乙醇、85%和75%酒精脫蠟至水。先后用蘇木素和伊紅染色,再將切片脫水處理,用中性樹膠封片。于顯微鏡下觀察,進行圖像采集分析。結(jié)果圖像中細胞核呈現(xiàn)藍色,細胞質(zhì)呈現(xiàn)紅色。

    1.3.7 腸道典型微生物含量測定

    用抗生素造成小鼠腸道菌群失調(diào)模型,分別采集小鼠給予受試物(L.plantarum P9菌粉)前以及最后一次給予受試物后的無菌新鮮糞便,對糞便中的腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌進行計數(shù)。糞便樣品用稀釋液稀釋至合適濃度,分別接種于相應(yīng)選擇培養(yǎng)基中,于(36±1)℃下培養(yǎng)。腸球菌在疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,腸桿菌在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h,雙歧桿菌在雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)48 h,乳桿菌用乳桿菌選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h,產(chǎn)氣莢膜梭菌用產(chǎn)氣莢膜梭菌選擇性培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)24 h。計算出每克糞便中的菌落數(shù)(cfu/g),再取對數(shù)進行計算。

    1.3.8 腸道菌群結(jié)構(gòu)16s rDNA高通量測序

    灌胃結(jié)束后,收集各組小鼠的無菌新鮮糞便,采用十六烷基三甲基溴化銨/十二烷基磺酸鈉(cetyltrimethylammonium bromide/sodium dodecyl sulfate,CTAB/SDS)法提取樣本中微生物DNA,檢測濃度及純度后,用無菌水將DNA稀釋成1 ng/μL,使用特異性引物 515F(5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3')和806R(3'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-5') 對細菌16S rRNA的V3~V4區(qū)進行PCR擴增,產(chǎn)物用2%瓊脂凝膠進行電泳檢測,再用Qiagen試劑盒純化。使用TruSeq ?DNApcr無樣品制備試劑盒生成測序文庫,用Qubit@2.0熒光計和安捷倫生物分析儀2100系統(tǒng)評估文庫質(zhì)量,在Illumina NovaSeq平臺上對文庫進行雙末端測序。測序原始數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過濾后得到有效數(shù)據(jù),在有效數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進行OTUs(operational taxonomic units)聚類和物種注釋及豐度分析,再經(jīng)T檢驗得到樣本間群落結(jié)構(gòu)差異特征。

    1.4 數(shù)據(jù)分析處理

    測量所得的各種數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。小鼠細胞炎癥因子、抗氧化指標(biāo)、臟器系數(shù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示,除腸道菌群計數(shù)采用獨立樣本T檢驗分析組間差異,其余數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析LSD法分析組間差異,當(dāng)P<0.05時則認為數(shù)據(jù)有顯著性差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 植物乳桿菌P9對小鼠體質(zhì)量和攝食量的影響

    各組小鼠的體質(zhì)量和攝食量隨時間的變化如圖1所示。

    圖1 植物乳桿菌P9對小鼠體質(zhì)重及攝食量的影響(n=12)Fig.1 Effect of L.plantarum P9 on body weight and food intake level of mice(n=12)

    由圖1可知,體質(zhì)量曲線和攝食量曲線都呈緩慢上升的趨勢,但各組之間差別不明顯。一方面,由于小鼠處于身體發(fā)育階段,隨著周齡的增長,體質(zhì)量和攝食量都有所增長;另一方面,說明本實驗所灌胃的頭孢曲松鈉和L.plantarum P9菌粉對小鼠的體質(zhì)量和攝食量無明顯影響。

    2.2 植物乳桿菌P9對小鼠臟器系數(shù)的影響

    臟器系數(shù)是反映藥物對動物機體各器官作用的參數(shù),其變化可提示臟器的形態(tài)病理學(xué)改變,臟器系數(shù)降低提示可能有萎縮或退行性病變,臟器系數(shù)升高則可能有水腫、增生或充血[13]。本次實驗中,各組小鼠的臟器系數(shù)如表1所示。

    表1 植物乳桿菌P9對小鼠各臟器系數(shù)的影響(n=12)Table 1 Effect of L.plantarum P9 on organ coefficient in mice(n=12)%

    由表1可知,無論是模型組與對照組,還是低劑量組、中劑量組、高劑量組與模型組相比較,小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胸腺的臟器系數(shù)均無明顯差異,說明頭孢曲松鈉和L.plantarum P9灌胃對小鼠的臟器無明顯影響。吳思謀等[14]的研究中通過高脂飲食和灌胃頭孢曲松的方式能檢測到小鼠臟器系數(shù)的明顯差異,而本實驗中臟器系數(shù)無顯著差異,說明小鼠臟器系數(shù)可能與飲食因素、抗生素灌胃劑量和灌胃持續(xù)時間有關(guān)系。

    2.3 植物乳桿菌P9對小腸長度和質(zhì)量的影響

    各組小鼠小腸的長度和質(zhì)量如圖2所示。

    圖2 植物乳桿菌P9對小鼠小腸長度和質(zhì)量的影響(n=12)Fig.2 Effect of L.plantarum P9 on length and weight of intestine in mice(n=12)

    由圖2可知,小腸長度無顯著差異,3個劑量組和模型組的小腸質(zhì)量比對照組稍有提高,但無顯著差異(P>0.05),說明頭孢曲松鈉和L.plantarum P9未對小鼠的小腸造成器質(zhì)性改變。

    2.4 植物乳桿菌P9對小鼠血清中炎癥因子的影響

    炎癥是機體受到外界刺激時的一種防御反應(yīng)[15],IL-1β、IL-2、IL-6、TNF-α 是機體常見的炎癥因子。IL-1β由活化巨噬細胞產(chǎn)生;IL-2由T輔助細胞產(chǎn)生,又稱T細胞生長因子;IL-6是由多種淋巴細胞或非淋巴細胞產(chǎn)生;TNF-α是由單核-巨噬細胞產(chǎn)生,這4種均為促炎細胞因子[16],其水平的高低對反應(yīng)機體的炎癥有重要價值。腸道菌群的失調(diào)則通常會促進全身炎癥反應(yīng),導(dǎo)致多種疾病發(fā)生[17],所以本次實驗中測定了各組小鼠這4種炎癥因子含量變化,結(jié)果見表2。

    表2 小鼠血清中炎癥因子水平Table 2 The level of inflammatory factor in mice serum

    由表2可知,與對照組相比,模型組的IL-1β、IL-2、IL-6及 TNF-α 含量極顯著升高(P<0.01);與模型組相比,低、中、高 3 個劑量組的 IL-2、IL-6、TNF-α 含量極顯著降低(P<0.01),中劑量組和高劑量組的IL-1β含量極顯著降低(P<0.01),說明灌胃頭孢曲松鈉導(dǎo)致小鼠機體產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng),而L.plantarum P9可以減輕小鼠由頭孢曲松鈉造成的炎癥反應(yīng),中劑量組和高劑量組效果更為明顯。

    2.5 植物乳桿菌P9對小鼠肝臟及小腸抗氧化指標(biāo)的影響

    機體的抗氧化系統(tǒng)是一個復(fù)雜而完善的整體[18],當(dāng)小鼠腸道菌群失調(diào)時,會破壞這個整體的平衡性。SOD是一種廣泛存在于生物機體的抗氧化金屬酶,能夠催化超氧陰離子歧化生成過氧化氫和氧,其活力值越高代表抗氧化的能力越強[19]。MDA是氧自由基攻擊生物膜后形成的脂質(zhì)氧化代謝物,其含量反映了體內(nèi)脂質(zhì)的過氧化程度[20],含量越高提示機體的抗氧化能力越弱。GSH是體內(nèi)重要的還原劑,參與多種生物氧化過程,對蛋白質(zhì)合成、DNA修復(fù)、細胞膜轉(zhuǎn)運以及細胞增殖、分化、凋亡等多種生物過程具有重要意義[21],低水平的GSH還會導(dǎo)致氧化應(yīng)激,進而影響免疫系統(tǒng)的功能。GSH-Px是一種過氧化物分解酶,其作用是消除機體產(chǎn)生的過氧化氫和有機氫過氧化物,降低活性氧對機體的破壞[22],此外它還參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、前列腺素合成的調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)相互作用等過程。本實驗中測定的各組小鼠肝臟和腸道組織MDA、GSH含量和T-SOD、GSH-Px活性如表3。

    表3 植物乳桿菌P9對小鼠肝臟和小腸抗氧化指標(biāo)的影響Table 3 Effect of L.plantarum P9 on antioxidant index in mice's liver and intestine

    由表3可知,與對照組相比,模型組小鼠肝臟GSH 含量顯著降低(P<0.05),而 T-SOD、GSH-Px活性極顯著下降(P<0.01),MDA含量極顯著上升(P<0.01)。隨著L.plantarum P9灌胃劑量的增加,小鼠肝臟中各抗氧化物質(zhì)水平有所恢復(fù),與模型組相比,高劑量組的GSH含量和T-SOD、GSH-Px活性極極顯著上升(P<0.01),MDA含量極顯著下降(P<0.01)。模型組腸道GSH含量和GSH-Px活性相對于對照組極顯著降低(P<0.01),MDA 含量顯著上升(P<0.05),T-SOD 活性顯著下降(P<0.05)。與模型組相比,中劑量組和高劑量組小鼠腸道MDA含量顯著下降(P<0.05),高劑量組GSH-Px活性極顯著升高(P<0.01),T-SOD活性顯著升高(P<0.05),GSH 含量極顯著升高(P<0.01)。由此可見,灌胃頭孢曲松鈉后小鼠肝臟和小腸的抗氧化能力呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢,而L.plantarum P9能使抗氧化指標(biāo)恢復(fù)至對照組水平,說明L.plantarum P9對頭孢曲松鈉小鼠的肝臟和小腸的氧化應(yīng)激水平有著調(diào)控作用。

    2.6 植物乳桿菌P9對小鼠小腸形態(tài)的影響

    各組小鼠的小腸空腸段病理切片經(jīng)HE染色后,結(jié)果如圖3所示。

    圖3 小鼠小腸切片形態(tài)觀察(200×)Fig.3 Morphological observation of intestine section of mice(200×)

    由圖3可知,各組小鼠小腸的絨毛結(jié)構(gòu)完整、邊緣整齊、數(shù)量豐富,絨毛長度和隱窩厚度都沒有明顯差異,未見絨毛腫脹或絨毛脫落。黏膜上皮內(nèi)有排列整齊的單層柱狀細胞,固有層腸腺數(shù)量豐富,中央乳糜管結(jié)構(gòu)清晰可見,肌纖維形態(tài)正常、排列規(guī)則,未見明顯炎癥。說明抗生素和L.plantarum P9均未對小鼠小腸形態(tài)造成明顯改變。

    2.7 植物乳桿菌P9對小鼠典型腸道微生物含量的影響

    腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌都是人類和動物腸道的正常菌群,其數(shù)量一般處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。本實驗探究了L.plantarum P9對頭孢曲松鈉小鼠腸道中這5中常見菌群的具體影響,結(jié)果見圖4。

    圖4 植物乳桿菌P9對小鼠腸道菌群計數(shù)的影響Fig.4 Effect of L.plantarum P9 on intestinal flora count in mice

    如圖4所示,在給予抗生素后,小鼠糞便中的腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量比對照組極顯著減少(P<0.001),產(chǎn)氣莢膜菌含量無明顯變化??股卦鞊p停止后,模型組各類微生物含量有所恢復(fù),其中腸桿菌含量與同期對照組相比極顯著升高(P<0.001),乳桿菌含量有所下降,腸球菌和雙歧桿菌無明顯差異。各劑量組與灌胃L.plantarum P9之前比,腸球菌、腸桿菌、雙歧桿菌、乳桿菌含量均有所恢復(fù),與同時期模型組相比,腸球菌、腸桿菌含量有所降低,中高劑量組雙歧桿菌、乳桿菌含量明顯升高。

    在給予L.plantarum P9前,模型組和低、中、高劑量組的上述種類微生物,除產(chǎn)氣莢膜菌外,都明顯下降,模型成立。產(chǎn)氣莢膜菌是一種廣泛分布于環(huán)境、動物及人體胃腸道的厭氧致病菌,其芽孢具有極強的抗逆性,不易殺死[23],本研究顯示,抗生素和益生菌均無法影響產(chǎn)氣莢膜菌在腸道的數(shù)量。雙歧桿菌和乳桿菌都是腸道中的有益細菌,此實驗中抗生素能使它們的數(shù)量下降,而L.plantarumP9能使它們含量有所上升。模型組與對照組相比腸球菌、腸桿菌含量上升,而在3個劑量組中它們的含量均減少,這2種細菌都具有抗生素耐藥性,其中腸球菌對多種抗生素表現(xiàn)為固有耐藥機制,而且具有獲得新抗菌耐藥機制的能力[24];腸桿菌對頭孢菌素類、頭霉素類、加酶抑制劑類抗生素表現(xiàn)為耐藥[25],說明抗生素造??赡芴岣吡四退幖毦暮?,而L.plantarum P9可使耐藥菌含量降低。

    2.8 干預(yù)對小鼠腸道微生物多樣性的影響

    利用16s rDNA高通量測序可以從整體水平檢測出腸道菌群的變化。

    2.8.1 基于OTUs聚類的Venn分析

    實驗采集了5組小鼠共30個樣本進行16S rDNA高通量測序。經(jīng)過對短讀序列拼接,平均每個樣品測得85 151條標(biāo)簽,質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量為64 800。以97%的一致性將序列聚類成OTUs,共得到3 394個OTUs。將所有樣本均一化處理后繪制Venn圖,當(dāng)樣本組數(shù)大于5時則展示為花瓣圖,見圖5。

    圖5 基于OTUs聚類的Venn圖Fig.5 The Venn diagram based on OTUs cluster analysis

    如圖5所示,對照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組OTUs數(shù)目分別為1 730、2 332、1 529、858、1 442,模型組與其他各組相比OTUs數(shù)量有所增加,但與對照組相比模型組特有的OTUs數(shù)目為859,3個劑量組特有的 OTUs數(shù)目為 680、373、599。

    2.8.2 Alpha物種多樣性分析

    Alpha物種多樣性結(jié)果見圖6。

    圖6 Alpha物種多樣性分析Fig.6 Alpha species diversity analysis

    由物種累積箱形圖可見(圖6A)隨著樣本量的增加,可觀察到的物種數(shù)目增加,即物種多樣性增加,且圖形位置趨于平緩,表明環(huán)境中的物種不會隨樣本量增加而急劇增加,樣本量充分,可以進行數(shù)據(jù)分析。物種多樣性曲線(圖6B)反映了各組樣本中的物種數(shù)量,可見頭孢曲松鈉誘導(dǎo)小鼠腸道菌群失調(diào)時,物種數(shù)目顯著增加,而L.plantarum P9灌胃可以降低小鼠腸道物種數(shù)量。通過Wilcoxon秩和檢驗(圖6C)可以發(fā)現(xiàn),測得的物種數(shù)在模型組與高劑量組、中劑量組、低劑量組間均具有顯著性差異(P<0.05),而在對照組與模型組、中劑量組、高劑量組間均無顯著性差異(P>0.05)。Shannon指數(shù)反映了不同組間樣本均一性的差別,當(dāng)同一組中各樣本OTUs序列數(shù)均一性越大時,Shannon指數(shù)越大,由圖6D可見與模型組相比低劑量組、中劑量組、高劑量組的Shannon指數(shù)都具有顯著性差異(P<0.05),與對照組相比模型組和低劑量組無顯著差異(P>0.05),而對照組與中劑量組、對照組與高劑量組組間有顯著性差異(P<0.05),低劑量組、中劑量組、高劑量組3組互相無顯著差異,說明L.plantarum P9使樣本均一性發(fā)生了改變。

    2.8.3 多樣品比較分析

    多樣品比較分析(beta diversity)是對不同樣品中的微生物群落進行比較分析,采用Qiime軟件計算unifrac距離,進行降維分析,主坐標(biāo)分析法(principal co-ordinates analysis,PCoA)提取主要元素和結(jié)構(gòu),選取貢獻率最大的組合作圖,結(jié)果如圖7所示。

    圖7 基于weighted unifrac距離的PCoA分析圖Fig.7 PCoA analysis chart based on weighted unifrac distance

    加權(quán)unifrac方法(weighted unifrac)能從樣本中的物種有無和物種豐度兩方面反映群落結(jié)構(gòu)關(guān)系,群落中組成結(jié)構(gòu)相似度高的更傾向于聚集在一起,而組成差異大的樣本會分散排列??梢姶藢嶒炛心P徒M樣本比較集中,相似度較高。而對照組和低、中、高劑量組樣本分散度較大,除模型組外的其他4個置信圈重疊部分較多,說明組間差異不顯著。此項分析表明灌胃頭孢曲松鈉后小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,而L.plantarum P9能使小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。

    2.8.4 物種相對豐度分析

    物種相對豐度分析結(jié)果見圖8。

    圖8 門水平物種豐度柱形圖和屬水平物種豐度柱形圖Fig.8 Column diagram of species abundance at phylum level and at genus level

    在物種組成方面,在門水平選取豐度排名前10(top 10)的物種繪制柱形圖(圖8A),對照組的主要菌有擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobiota),在 top 10中占比91.3%,其中擬桿菌門占49.41%,厚壁菌門占35.3%,疣微菌門占6.59%。在屬水平選取豐度排名前10的屬繪制柱形圖(圖8B),各組的優(yōu)勢菌屬有阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、杜氏桿菌屬(Dubosiella)、毛螺旋菌屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group)。Top 10的菌屬在模型組的總豐度相對較低,在低、中、高劑量組相對較高。模型組Akkermansia豐度有所降低,擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)豐度有所升高,而在給予L.plantarum P9后,Akkermansia豐度升高,Alloprevotella豐度降低。除此之外,低、中、高劑量組的普雷沃菌屬(Prevotellaceae_UCG-001)、別樣桿菌屬(Alistipes)相對于對照組和模型組明顯升高,高劑量組Dubosiella相對于其他組明顯升高。此部分結(jié)果概括說明了L.plantarum P9能改善小鼠腸道因灌胃頭孢曲松鈉造成的菌群變化。

    2.8.5 物種顯著性差異分析

    利用T檢驗對各組間的差異物種進行分析,繪制heatmap圖,見圖9。

    圖9 組間差異物種分析heatmap圖Fig.9 The heatmap diagram of species differences between groups

    從屬水平看,與對照組相比,模型組擬普雷沃氏菌屬(Alloprevotella)豐度極顯著增多(P<0.01),厭氧支原體屬(Anaeroplasma)、腸單胞菌屬(Intestinimonas)、庫特氏菌屬(Kurthia)豐度顯著增多(P<0.05),氣味桿菌屬(Odoribacter)豐度極顯著減少(P<0.01)。Alloprevotella是從人類口腔分離出來的新型菌,臨床研究顯示,Alloprevotella感染與下頜骨骨髓炎和口腔鱗狀癌有密切聯(lián)系[26]。Anaeroplasma是柔膜體綱8個屬之一,是引起人和動物呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)炎癥的主要致病菌[27]。Intestinimonas是小鼠腸道的一種能產(chǎn)生丁酸鹽的細菌,對抗生素有一定耐藥性[28]。Kurthia為一種食品致腐階段性參與菌,具有抗逆性和多重降解功能,研究顯示它能夠降解農(nóng)田中殘留的抗生素[29]。上述結(jié)果表明抗生素造損后上述致病菌及具有抗生素抗性的微生物豐度有所增加。

    灌胃L.plantarum P9后,與模型組相比,低、中、高劑量組的腸球菌屬(Enterococcus)豐度顯著減少(P<0.05),腸桿菌屬(Enterobacter)、魏斯氏菌屬(Weissella)、乳球菌屬(Lactococcus)豐度極顯著減少(P<0.01),而 Prevotellaceae_UCG-001、理研菌屬(Alistipes)、擬桿菌屬(Bacteroides)豐度有所增加。低劑量組杜氏桿菌(Dubosiella)豐度極顯著升高(P<0.01),顫螺旋菌屬(Oscillibacter)、Colidextribacter、惰性真桿菌([Eubacterium]_siraeum_group)豐度極顯著升高(P<0.01);中劑量組 Colidextribacter豐度顯著減少(P<0.05),阿克曼菌(Akkermansia)豐度顯著上升(P<0.01);高劑量組卡斯特蘭尼氏菌屬(Castellaniella)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)豐度顯著升高(P<0.05),Intestinimonas豐度顯著降低(P<0.05)。腸球菌、腸桿菌和雙歧桿菌的結(jié)果與2.7部分相吻合。魏斯氏菌、乳球菌、杜氏桿菌都屬于乳酸菌,目前關(guān)于魏斯氏菌抗生素耐藥性暫無報道,但研究顯示乳球菌對大多數(shù)常用抗生素具有不同程度耐藥性[30],阿克曼菌是一種黏蛋白分解細菌,研究顯示其與肥胖、代謝性疾病、炎癥呈負相關(guān),不僅可以保護小腸上皮細胞完整性,還可以通過調(diào)節(jié)T細胞發(fā)揮抗炎作用[31]。說明灌胃L.plantarum P9后,與模型組相比具有抗生素抗性的細菌豐度減少,同時腸道內(nèi)一些有益細菌豐度有所增加。

    綜上所述,灌胃抗生素使小鼠腸道對抗生素有耐藥性和降解功能的細菌增加,使得它們的OTUs數(shù)目高于對照組和3個劑量組,而灌胃L.plantarum P9后能夠降低這些細菌的數(shù)目,使其恢復(fù)至對照組水平,其中高劑量組的效果更加明顯。

    3 結(jié)論

    本文探究了植物乳桿菌P9對頭孢曲松鈉誘導(dǎo)的腸道菌群失調(diào)小鼠的作用,結(jié)果顯示植物乳桿菌P9能夠降低小鼠因腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng),提高肝臟和小腸的氧化應(yīng)激水平。灌胃抗生素頭孢曲松鈉導(dǎo)致小鼠腸道對抗生素耐藥的細菌豐度增加,而植物乳桿菌P9可以降低耐藥細菌的豐度,植物乳桿菌P9具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。

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