高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生酵母的快速篩選及其糖苷酶釀造適應(yīng)性研究

馬得草，游 靈，李?lèi)?ài)華，牟 含，陶永勝,3

(1西北農(nóng)林科技大學(xué) a葡萄酒學(xué)院，b食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌712100；2宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓644000；3陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌712100)

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)由于具有較強(qiáng)的酒精和二氧化硫耐受性及發(fā)酵較為純凈的優(yōu)點(diǎn)，在葡萄酒酒精發(fā)酵過(guò)程中被大量使用[1]。令人擔(dān)憂的是，越來(lái)越多的酒莊和釀酒師采用釀酒酵母干粉啟動(dòng)發(fā)酵，使葡萄酒的品質(zhì)風(fēng)格面臨單一化，葡萄酒產(chǎn)品有喪失葡萄本身品種特性和地域風(fēng)格的危險(xiǎn)[2-3]。葡萄酒香氣特征是產(chǎn)品風(fēng)格的重要呈現(xiàn)形式，葡萄酒的典型風(fēng)味主要來(lái)源于葡萄本身豐富的糖苷類(lèi)香氣前體物質(zhì)，它們通常需經(jīng)過(guò)酸解或者酶解釋放出游離態(tài)香氣成分后才能表現(xiàn)出香氣特征[4-5]。在葡萄酒釀造過(guò)程中，主要是酶促水解促進(jìn)葡萄品種香氣特征的形成，而水解香氣糖苷形成揮發(fā)性香氣成分的關(guān)鍵酶是β-葡萄糖苷酶。葡萄果粒和釀酒酵母是常規(guī)釀造過(guò)程中酶促反應(yīng)主要酶的來(lái)源，但是典型的葡萄酒生產(chǎn)條件，如高糖、高酒精、低pH值和高濃度多酚等，限制了葡萄與釀酒酵母中糖苷酶的活性[6]。研究表明，某些野生酵母分泌的β-葡萄糖苷酶能夠適應(yīng)葡萄酒釀造環(huán)境，更充分地水解這些糖苷類(lèi)物質(zhì)[7-8]，因此許多釀酒師開(kāi)始注重這些優(yōu)選野生酵母在釀酒中的應(yīng)用[9-13]。

我國(guó)幅員遼闊，各地生態(tài)資源差異很大，野生酵母種屬資源頗多。此外我國(guó)是白酒、啤酒產(chǎn)業(yè)大國(guó)，葡萄酒產(chǎn)業(yè)也已迅速成長(zhǎng)，不同釀酒環(huán)境中也蘊(yùn)含著大量適宜釀酒的酵母菌資源，篩選優(yōu)良的野生酵母菌株并研究其釀酒特性對(duì)于酒類(lèi)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。對(duì)于高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母的篩選，一般實(shí)驗(yàn)室條件下經(jīng)濟(jì)適用的篩選方法是采用對(duì)硝基苯基葡萄糖苷(p-NPG)水解法，通過(guò)培養(yǎng)液的光譜吸收值計(jì)算酶活性[12]，如果沒(méi)有酶標(biāo)儀的輔助，該法不適宜大量樣本的快速篩選。因?yàn)橐吧湍纲Y源常常在野外采樣，且中小型酒莊實(shí)驗(yàn)室條件有限，所以亟待開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快捷的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母的篩選方法。在河西走廊葡萄自然發(fā)酵環(huán)境下，侯曉瑞等[14]通過(guò)含p-NPG的培養(yǎng)基平板上黃色透明圈直徑大小及顏色深淺，從115株野生酵母中初篩出44株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株，但是該法效率仍需改進(jìn)。本研究根據(jù)β-葡萄糖苷酶可以將七葉苷水解為七葉苷原并與Fe3+作用顯棕黑色的原理，結(jié)合96孔板的酵母培養(yǎng)液試管，設(shè)計(jì)建立基于七葉苷半定量比色法的高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株快速篩選方法，并研究?jī)?yōu)選菌株β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄酒釀造環(huán)境的適應(yīng)性，旨在為具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及其在釀酒產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的133株野生酵母菌株從四川宜賓多家濃香型白酒酒窖(糟醅、窖泥、曲房)中分離，于-20 ℃、體積分?jǐn)?shù)40%甘油中保藏。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：酶標(biāo)儀(SpectraMax M2，美國(guó)Molecular Devices公司)、無(wú)菌操作臺(tái)(SW-CJ-1FD，中國(guó)蘇凈安泰公司)、冷凍高速離心機(jī)(22331 Hamburg，德國(guó)Eppendorf 公司)、顯微鏡(Olympus BX51TF，日本Olympus公司)、微量紫外分光光度計(jì)(Nanodrop 1000，美國(guó)Thermo scitific公司)、電泳儀(DYY-8C型，北京六一儀器廠)、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(ChampGe I 5000增強(qiáng)型，北京賽智創(chuàng)業(yè)有限公司)。

所用試劑：七葉苷、對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯基葡萄糖苷(p-NPG)，上海源葉生物科技有限公司；Premix Ex TaqTM、6×DNA Loading Buffer、2000 bp DNA Marker、引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)[15]，購(gòu)于大連寶生物公司；無(wú)水碳酸鈉、檸檬酸、磷酸二氫鈉，均為分析純，購(gòu)于天津化學(xué)試劑有限公司。

培養(yǎng)基：七葉苷篩選培養(yǎng)基(七葉苷3 g/L，檸檬酸鐵0.5 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，瓊脂20 g/L)。其他培養(yǎng)基，如YEPD液體培養(yǎng)基、WLN固體培養(yǎng)基、擴(kuò)增培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基[16-17]。

1.3 七葉苷半定量顯色法初篩菌株

根據(jù)β-葡萄糖苷酶可以將七葉苷水解為七葉苷原，七葉苷原與Fe3+作用顯棕黑色的原理，使用半定量比色方法對(duì)菌株進(jìn)行初篩。將活化的菌株接種到96孔板上的七葉苷培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)72 h后，根據(jù)顯色結(jié)果將顏色定義為最高酶活性(深黑“++++”)、高酶活性(黑“+++”)、中酶活性(深灰“++”)、低酶活性(灰“+”)和無(wú)酶活性(白“-”) 5種顯色水平，原理如圖1。通過(guò)目測(cè)比色法從133株野生酵母菌株中挑選出10～20株顯色水平有差異的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株，檢測(cè)β-葡萄糖苷酶活性，評(píng)價(jià)七葉苷半定量顯色法的篩選效果。

圖1 七葉苷半定量比色法的篩選原理Fig.1 The screening principle of semi-quantitative colorimetric method with esculin hydrate

1.4 p-NPG法復(fù)篩驗(yàn)證菌株

將活化的初篩菌株以5%的接種量接于擴(kuò)增培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min擴(kuò)增培養(yǎng)72 h后，以10%的接種量將擴(kuò)培液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min下培養(yǎng)72 h后，8 000 r/min離心發(fā)酵液8 min后取上清液，經(jīng)超濾去除10 ku大分子物質(zhì)，制成糖苷酶提取液，用于復(fù)篩以及酶學(xué)特性研究，4 ℃條件下保存。

將200 μL糖苷酶提取液、750 μL檸檬酸-磷酸緩沖液(pH 5.0)和250 μL 1 mmol/Lp-NPG混合，40 ℃水浴30 min后加入1.0 mL的1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)液的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算β-葡萄糖苷酶活性，并以此為依據(jù)復(fù)篩得到高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株。β-葡萄糖苷酶活性單位(U)定義為：40 ℃、pH 5.0條件下1 min內(nèi)催化生成1 μmol對(duì)硝基苯酚所要的酶量。

1.5 優(yōu)選菌株的鑒定及其β-葡萄糖苷酶特性

1.5.1 菌落形態(tài)特征及細(xì)胞顯微觀察 將優(yōu)選菌株活化后劃線接種于WLN固體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)72 h，根據(jù)在WLN固體培養(yǎng)基的菌落特征對(duì)其進(jìn)行初步分類(lèi)，并在10×100倍顯微鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)。

1.5.2 26S rDNA D1/D2區(qū)域序列分析 優(yōu)選菌株DNA的提?。翰捎檬⑸捌票诜╗18]。PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：Premix Ex TaqTM12.5 μL，引物NL1和NL4各1 μL，DNA模板1 μL，添加雙蒸水9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環(huán)36次；再72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，控制電壓120 V，時(shí)間50 min，電泳結(jié)束后用2 μg/mL ED浸染20 min，蒸餾水洗脫5 min后置于凝膠成像系統(tǒng)調(diào)試拍照，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果,利用Blast軟件從GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源序列搜索，確定菌株種屬。

1.5.3β-葡萄糖苷酶的葡萄酒環(huán)境適應(yīng)性 模擬葡萄酒釀造環(huán)境中的重要條件，設(shè)置酵母糖苷酶提取液在不同溫度(20，30，40，50，60，70 ℃)、pH值(3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0)、葡萄糖質(zhì)量濃度(100，150，200，250，300 g/L)和酒精度(體積分?jǐn)?shù)) (5%，10%，15%)的試驗(yàn)條件，檢測(cè)β-葡萄糖苷酶活性的變化，研究溫度、pH值、葡萄糖質(zhì)量濃度、酒精度對(duì)優(yōu)選菌株β-葡萄糖苷酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

根據(jù)96孔板七葉苷培養(yǎng)基的顯色深淺(圖2)，從133株菌株中快速篩選出19株顯色水平有差異的菌株，該法一目了然，快速、便捷。使用p-NPG水解法測(cè)定19株菌株β-葡萄糖苷酶活性，得到顯色水平及β-葡萄糖苷酶活性大小見(jiàn)表1。通過(guò)比較顯色水平和β-葡萄糖苷酶活性數(shù)值大小，七葉苷半定量顯色法的顯色水平與p-NPG檢測(cè)的β-葡萄糖苷酶活性具有正線性相關(guān)性，依據(jù)β-葡萄糖苷酶活性的大小篩選出2株活性較高且穩(wěn)定的酵母菌株H5Y1和Z9Y3。

圖2 供試菌株在七葉苷培養(yǎng)基中的顯色篩選Fig.2 The color screening of strains in esculin medium

菌株編號(hào)No.ofstrains顯色水平Colorlevelβ-葡萄糖苷酶活性/(mU·mL-1)β-glucosidaseactivities菌株編號(hào)No.ofstrains顯色水平Colorlevelβ-葡萄糖苷酶活性/(mU·mL-1)β-glucosidaseactivitiesH5Y1++++39.71±1.44aG8Y2+++19.71±2.62dZ9Y3++++37.80±0.94abH9Y1+++19.22±2.51dH7Y9++++35.49±1.77abcH7Y8+++18.90±2.11dS6Y2++++33.86±1.96abcH8Y1+++18.59±2.72dH7Y5++++33.15±1.77bcW8Y1+++18.27±1.11dS5Y1++++32.16±1.74bcH9Y4++15.08±0.81dS8Y2++++30.15±1.44cH9Y2++14.95±2.46dS4Y9++++29.02±1.38cS4Y2++14.95±1.32dS8Y6+++19.95±1.73dS8Y5++14.28±2.84dW8Y5+++19.86±2.96d

注：++++、+++、++表示的顯色水平同圖1。同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示顯著性差異(P<0.05)。

Note:++++,+++,and ++ mean same color levels as Fig.1.Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

2.2 優(yōu)選菌株的鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)與細(xì)胞形態(tài) 使用WLN固體培養(yǎng)基對(duì)優(yōu)選酵母菌株培養(yǎng)72 h，觀察菌落形態(tài)，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。菌株H5Y1(圖3-a)菌落呈米白色，不透明，表面有褶皺，邊緣粗糙，細(xì)胞呈橢圓狀，有出芽現(xiàn)象；菌株Z9Y3(圖3-b)菌落呈乳白色，不透明，表面粗糙，有褶皺，邊緣粗糙，細(xì)胞呈橢圓狀，有出芽現(xiàn)象。

a.H5Y1 b.Z9Y3圖3 優(yōu)選酵母菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)Fig.3 The colony and cell morphology of yeasts selected

2.2.2 菌株26S rDNA D1/D2序列分析 對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。根據(jù)測(cè)序結(jié)果與GenBank中已發(fā)表的菌株進(jìn)行核苷酸同源性對(duì)比，菌株H5Y1和菌株Z9Y3的基因與發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)的KM589463.1和HE660054.1基因的同源性達(dá)到99%和99%，因此可確定2株菌株均為發(fā)酵畢赤酵母菌株。

M.2 000 bp DNA Marker;1.H5Y1;2.Z9Y3

2.3 優(yōu)選菌株β-葡萄糖苷酶的葡萄酒環(huán)境適應(yīng)性

2.3.1 溫度對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響 將優(yōu)選菌株糖苷酶提取液在不同溫度下培養(yǎng)，1 h后測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性，以提取液在40 ℃、pH 5.0條件下的β-葡萄糖苷酶活性(即100%)為比對(duì)，用相對(duì)酶活性表示不同溫度條件對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響(下同)，結(jié)果如圖5-a所示。由圖5-a可以看出，在葡萄酒典型發(fā)酵溫度(20～30 ℃)下，2株菌糖苷酶提取液中β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活性在70%左右，50 ℃時(shí)相對(duì)酶活性最高，當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)優(yōu)選菌株β-葡萄糖苷酶的相對(duì)酶活性急劇下降，70 ℃時(shí)相對(duì)酶活性分別為15.2%和22.0%。將2株菌糖苷酶提取液在20 ℃分別保溫24，48，72 h，結(jié)果(圖5-b)顯示，β-葡萄糖苷酶相對(duì)酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)持續(xù)下降，72 h后H5Y1菌株的β-葡萄糖苷酶活性只保留了初始酶活性的51.1%，Z9Y3則保留了52.3%。

a.培養(yǎng)1 h后測(cè)定；b.20 ℃保溫24,48,72 h后測(cè)定a.Measuring after being kept 1 h at different temperature;b.Measuring after being kept 24,48,72 h at 20 ℃

2.3.2 pH值對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響 在pH值3.0～7.0，調(diào)整優(yōu)選菌株糖苷酶提取液的pH 值，1 h后測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性，結(jié)果(圖6-a)顯示，H5Y1與Z9Y3所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶在pH 5.0時(shí)相對(duì)酶活性最高。12 h后測(cè)定β-葡萄糖苷酶活性，結(jié)果(圖6-b)表明，在pH 3.0～6.0時(shí)，2株菌糖苷酶提取液中β-葡萄糖苷酶活性仍然能保持初始酶活性的90%左右，pH值7.0時(shí)相對(duì)酶活性降為78.1%和74.0%。說(shuō)明優(yōu)選菌株β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄酒酸性環(huán)境(pH值2.9～3.6)具有一定的耐受性。

2.3.3 葡萄糖和酒精度對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響 葡萄糖質(zhì)量濃度和酒精度對(duì)糖苷酶提取液中β-葡萄糖苷酶活性的影響結(jié)果見(jiàn)圖7和圖8。由圖7可以看出，隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的升高，2株菌β-葡萄糖苷酶活性均降低，葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)β-葡萄糖苷酶活性能保持初始酶活性的95%以上，葡萄糖質(zhì)量濃度為200 g/L時(shí)相對(duì)酶活性在85%左右，葡萄糖質(zhì)量濃度300 g/L時(shí)2株菌的β-葡萄糖苷酶活性僅能保持初始酶活性的77.4%和79.0%。由圖8可以看出，與葡萄糖的抑制作用不同，在酒精度為5%～15%時(shí)，隨著酒精度的增加，提取液中β-葡萄糖苷酶活性呈上升趨勢(shì)，酒精度為10%以上時(shí)，對(duì)β-葡萄糖苷酶活性有促進(jìn)作用，尤其是對(duì)Z9Y3菌株的β-葡萄糖苷酶。因此，優(yōu)選菌株的β-葡萄糖苷酶完全可適應(yīng)葡萄酒的酒精環(huán)境。

a.培養(yǎng)1 h后測(cè)定；b.培養(yǎng)12 h后測(cè)定a.Measuring after being kept 1 h at different pH levels;b.Measuring after being kept 12 h at different pH levels

圖7 葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)β-葡萄糖苷酶活性的影響Fig.7 Effect of glucose content on β-glucosidase activity

3 討論與結(jié)論

本研究中，配置七葉苷培養(yǎng)基，結(jié)合96孔板的酵母培養(yǎng)液試管，根據(jù)β-葡萄糖苷酶可以將七葉苷水解為七葉苷原并與Fe3+作用顯棕黑色的原理，設(shè)計(jì)了七葉苷半定量顯色法篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的野生酵母菌株，篩選結(jié)果中高產(chǎn)菌株培養(yǎng)基顯色明顯、直觀明了，與此前研究報(bào)道的纖維素-剛果紅篩選培養(yǎng)基[19]和以p-NPG為底物的YEPD平板培養(yǎng)基[14]的篩選效果相比，具有很高的辨識(shí)度，并且七葉苷半定量顯色法的成本較低，方便快捷，具有明確的創(chuàng)新性。

近些年來(lái)，許多研究報(bào)道了優(yōu)選野生酵母在葡萄酒釀造中的應(yīng)用，比如裂殖酵母(Schizosaccharomyces)[20]、異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)[21-22]、有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)[23-24]等，它們大多通過(guò)與釀酒酵母的混合接種發(fā)酵，提高葡萄酒的風(fēng)味復(fù)雜性。本試驗(yàn)以β-葡萄糖苷酶活性大小作為選擇標(biāo)準(zhǔn)，最終優(yōu)選2株高產(chǎn)菌株H5Y1和Z9Y3，β-葡萄糖苷酶活性分別達(dá)到39.71和37.80 mU/mL，2株菌經(jīng)26S rDNA D1/D2 序列分析均鑒定為發(fā)酵畢赤酵母(Pichiafermentans)。同時(shí)，提取液在20 ℃條件下保溫72 h后，β-葡萄糖苷酶活性能夠保持初始酶活性的51.1%以上，在pH 3.0條件下保持12 h后，β-葡萄糖苷酶活性能夠保持在初始酶活性的90.0%以上，在100～200 g/L葡萄糖質(zhì)量濃度和5%～15%(體積分?jǐn)?shù))酒精度的2個(gè)不同條件下，β-葡萄糖苷酶活性分別能夠保持在初始酶活性的84.0%和90.0%以上。說(shuō)明優(yōu)選菌株β-葡萄糖苷酶具有較好的葡萄酒釀造環(huán)境適應(yīng)性。雖然已有研究報(bào)道了發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母的混合發(fā)酵可提高葡萄酒中發(fā)酵香氣成分的含量，如1-丙醇、乙酸乙酯、正己醇、2,3-丁二醇等[25]，但優(yōu)選發(fā)酵畢赤酵母菌株在發(fā)酵中影響葡萄品種香氣的相關(guān)研究數(shù)據(jù)缺乏，優(yōu)選菌株及其糖苷酶進(jìn)行葡萄酒增香釀造的應(yīng)用效果還需進(jìn)一步深入研究。

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