PBX3在宮頸癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)和預(yù)后關(guān)系

杜昌宇

廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院(545000)

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤，死亡率較高[1]。宮頸癌發(fā)生發(fā)展受到較多因素的影響，病毒感染、多個(gè)性伴侶、多產(chǎn)、初次性生活<16歲、吸煙等均為宮頸癌的高發(fā)因素[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中有關(guān)基因發(fā)生改變可導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生，因此探究宮頸癌的發(fā)生機(jī)理對(duì)于尋找宮頸癌治療靶點(diǎn)具有十分重要的積極意義[3]。前B細(xì)胞白血病同源盒基因3(PBX3)屬PBX家族成員之一，在白血病研究中較多。近期研究顯示，其在胃癌等腫瘤中分子表達(dá)量明顯高于癌旁組織，且與患者腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲、遷移有關(guān)[4]。但目前在宮頸癌中未見研究。本研究通過探究PBX3在宮頸癌組織的表達(dá)及臨床意義，為治療宮頸癌提供新靶點(diǎn)提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2012年3月—2015年3月手術(shù)治療的宮頸癌組織及癌旁組織。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí)；②術(shù)前未經(jīng)放療、化療或其它腫瘤相關(guān)治療；③臨床資料、術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它腫瘤；②代謝異常性疾病；③急性心、腦血管疾病者；④肺、肝、膽、腎等重要器官發(fā)受損。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

蛋白提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；PVDF膜購自Thermo Fisher Scientific公司；電泳儀購自美國Beckman公司；Nanodrop蛋白測定儀器購自德國NanolytiK公司；顯微鏡購自olympus公司。

1.3 檢測方法

1.3.1蛋白免疫印跡(WB)分析使用RIPA蛋白提取試劑裂解組織提取蛋白質(zhì)， 4℃ 12000g離心10min， 12% SDS-PAGE電泳分離蛋白，蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到PDVF膜上,封閉1h，添加PBX3一抗(1:500)4℃孵育過夜，添加二抗室溫下孵育1h。以β-actin蛋白表達(dá)作為內(nèi)參，采用Quantity One軟件評(píng)估蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2免疫組織化學(xué)分析常規(guī)制備石蠟組織切片(4μm)，二甲苯脫蠟，梯度濃度酒精脫水。將切片置于檸檬酸鈉溶液孵育20min，3%過氧化氫孵育10min，10%正常山羊血清中孵育30min，添加PBX3一抗4℃孵育過夜；添加生物素化的二抗孵育30min，添加鏈霉親和素過氧化物酶孵育15min。磷酸緩沖液洗滌后，添加100μl DAB溶液，顯微鏡下觀察直至顯色；水洗后添加蘇木精復(fù)染，氨水反藍(lán)后自來水沖洗。切片乙醇脫水二甲苯中透明。

1.3.3評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)PBX3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，染色后陽性表達(dá)呈棕色顆粒。染色強(qiáng)度由兩名資深病理學(xué)醫(yī)師以半定量法[5]評(píng)分，主要從染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比評(píng)定[10]。①陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。②染色強(qiáng)度分級(jí)：陰性為0分，弱度為1分，中度為2分，強(qiáng)度為3分。兩個(gè)分?jǐn)?shù)相乘計(jì)算最終得分：≥6分為陽性，<6分為陰性。

1.4 隨訪

對(duì)患者進(jìn)行30個(gè)月隨訪。在本院長期治療、復(fù)查病例詳細(xì)登記；不在本院復(fù)查患者采用電話隨訪。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象基本情況

共納入資料82例，年齡(51.5±5.4)歲(36～60歲)；鱗癌68例、腺癌14例；組織高分化39例，中分化26例，低分化17例； TNM分期為Ⅰ期39例，Ⅱ期23例，Ⅲ期20例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移58例。

2.2 PBX3在宮頸癌組織中蛋白表達(dá)

PBX3蛋白表達(dá)宮頸癌組織(0.95±0.11)高于癌旁組織(0.18±0.03)(t= 60.154，P=0.000)。見圖1。

圖1 PBX3蛋白表達(dá)

2.3 在宮頸癌組織中PBX3蛋白陽性表達(dá)

宮頸癌組織中PBX3蛋白陽性表達(dá)率(38.8%，31/82)高于癌旁組織(30.0%,18/82)(χ2= 4.919，P=0.027)。見圖2。

圖2 PBX3蛋白陽性表達(dá)(200×)

2.4 PBX3表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

宮頸癌患者82例中，PBX3蛋白陽性表達(dá)31例，陰性表達(dá)51例。PBX3表達(dá)與患者年齡、病理類型、腫瘤浸潤深度無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、浸潤程度淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 宮頸癌組織 PBX3表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.5 影響宮頸癌患者預(yù)后的COX回歸分析

82例均隨訪30個(gè)月，30人死亡，死亡率為36.6%。將臨床病理參數(shù)納入COX回歸分析，單因素結(jié)果顯示年齡、腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PBX3表達(dá)為影響患者預(yù)后的因素；多因素分析顯示，腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PBX3為影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。見表2。

表2 影響宮頸癌患者預(yù)后的COX回歸分析

2.6 PBX3表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

PBX3陽性表達(dá)31例中18例(58.1%)死亡；陰性表達(dá)51例中12例(23.5%)死亡。Kaplan-Meier生存曲線顯示，PBX3陽性或陰性表達(dá)患者總體生存率存在差異(P<0.05)。

圖3 PBX3表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

宮頸癌屬于臨床常見婦科腫瘤，發(fā)生機(jī)制目前尚不明確。多數(shù)認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展屬于多因素、多步驟過程，是多種基因、蛋白共同作用的結(jié)果[6-7]。為尋找宮頸癌診斷、治療的有效分子標(biāo)志物，本研究檢測PBX3在胃癌中的表達(dá)以及與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，以期為宮頸癌的診斷、治療提供一定的參考。

PBX3為PBX家族成員之一，在細(xì)胞發(fā)育、進(jìn)化中發(fā)揮重要功能。有研究顯示其與原癌基因功能相同，當(dāng)基因異常表達(dá)時(shí)誘發(fā)腫瘤的發(fā)生[8]。在結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PBX3后能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力，其機(jī)制與激活MAPK信號(hào)通路磷酸化水平有關(guān)[9]。在前列腺癌研究中顯示，PBX3在前列腺腫瘤中呈高表達(dá)，且為Let-7d分子的靶基因，經(jīng)Let-7d調(diào)控后增加PBX分子表達(dá)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[10]。Han等研究發(fā)現(xiàn)，PBX3為miR-33a-3P的靶基因，其能夠直接抑制PBX3進(jìn)而抑制人肝癌細(xì)胞遷移、侵襲[11]。基于PBX3在其它腫瘤中的作用，本研究推測其在宮頸癌中可能也具有一定的作用。經(jīng)過分子生物學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，宮頸癌組織中PBX3蛋白、蛋白陽性表達(dá)率均升高，這與在卵巢癌、多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞[12-13]中報(bào)道相一致，說明PBX3在宮頸癌中可能發(fā)揮促癌基因的作用。

為進(jìn)一步明確PBX3蛋白陽性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，本研究結(jié)果顯示,PBX3表達(dá)與年齡、病理類型、腫瘤浸潤深度無關(guān)，與腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、浸潤程度淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示隨著PBX3蛋白表達(dá)的升高，宮頸癌腫瘤惡性程度越高，病情進(jìn)展快，進(jìn)一步促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果均顯示PBX3參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，且與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著促進(jìn)調(diào)節(jié)的作用。

有研究顯示，除家族史、流產(chǎn)次數(shù)、吸煙等外，分子遺傳因素也為宮頸癌發(fā)生的高危因素[14-15]。在前列腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，高水平PBX3為前列腺發(fā)生的高風(fēng)險(xiǎn)因子，在前列腺診斷中有一定預(yù)測價(jià)值[16]。本研究單因素分析顯示，年齡、腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PBX3表達(dá)可能為影響患者預(yù)后的因素；多因素分析顯示，腫瘤分期、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PBX3為影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。提示PBX3表達(dá)升高為宮頸癌危險(xiǎn)因素。

宮頸癌不能完全根治，患者2年內(nèi)復(fù)發(fā)率較高。有調(diào)查顯示，復(fù)發(fā)者平均生存期僅為7個(gè)月，探究影響其預(yù)后的有效生物學(xué)指標(biāo)，對(duì)其預(yù)測、治療十分重要[17]。PBX3表達(dá)水平與患者預(yù)后密切相關(guān)。PBX3異常表達(dá)導(dǎo)致其蛋白功能改變，進(jìn)而引發(fā)癌變，影響患者預(yù)后。在急性髓細(xì)胞白血病研究中顯示，PBX3為患者預(yù)后不良的重要因素，且高表達(dá)者預(yù)后不良[18]。結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)，PBX3高表達(dá)者生存期明顯低于低表達(dá)者，患者預(yù)后較差[19]。本研究PBX3陽性表達(dá)者30個(gè)月累計(jì)生存率明顯低于陰性表達(dá)者生存率，兩組Kaplan-Meier生存曲線對(duì)比具有差異性，提示PBX3表達(dá)與患者預(yù)后相關(guān)，且高表達(dá)者預(yù)后不良。

綜上所述，PBX3在宮頸癌中發(fā)揮著促腫瘤進(jìn)展的作用，在宮頸癌中呈高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、浸潤深度等相關(guān)，并且為宮頸癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與患者不良預(yù)后有關(guān)。但由于宮頸癌的發(fā)生發(fā)展為多因素、多階段過程，本研究僅從臨床角度探究其表達(dá)意義，而有關(guān)PBX3分子機(jī)制研究仍需深入研究，為宮頸癌的預(yù)防和治療提供新的參考。