吳曉花,吳新義,汪 穎,汪寶根,魯忠富,徐 沛,李國景
(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所,浙江 杭州 310021)
瓠瓜[Lagenariasiceraria(Mol.) Standl.] (2n=2x=22),又名瓠子、扁蒲、葫蘆、蒲瓜、長瓜等,屬于葫蘆科葫蘆屬,一年生草本植物。瓠瓜既可以嫩果作新鮮蔬菜,也可以成熟果實(shí)作容器。浙蒲1號、浙蒲6號、浙蒲8號、浙蒲9號是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所育成的瓠瓜系列品種,它們以瓜形美觀、鮮味濃、口味佳等諸多優(yōu)點(diǎn)而廣受市場歡迎。等位基因(位點(diǎn))的差異是導(dǎo)致表型多樣性的重要原因。通過檢測不同品種中的基因型,可推測出其對應(yīng)的表型特征。例如水稻的落粒性基因qSH1,具有與Kasalath一樣的SNP位點(diǎn)的都是落粒品種,而具有與日本晴一樣的SNP位點(diǎn)的都是不落粒品種[1]。大豆的有限和無限結(jié)莢習(xí)性由Dt1和Dt2位點(diǎn)的等位變異同時控制,Dt1表達(dá)越強(qiáng)的品種,無限結(jié)莢習(xí)性越突出[2]。在黃瓜中,Bt基因控制果實(shí)的苦味,不同品種中Bt上的SNP,決定了該品種有無苦味[3]。
瓠瓜瓜形的美觀程度對消費(fèi)者選購具有重要的直觀影響,鮮味則在瓠瓜的風(fēng)味構(gòu)成中占突出地位。瓜形和鮮味均是復(fù)雜性狀,由多基因控制。全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS) 是研究作物復(fù)雜性狀遺傳結(jié)構(gòu)的有效手段[4-6]。在我們前期的研究中,曾利用GWAS的方法在瓠瓜基因組上鑒定出16個與鮮味氨基酸含量顯著相關(guān)的SNPs和37個與瓜形顯著相關(guān)的SNPs[7-8]。通過分析鮮味與游離氨基酸含量之間的關(guān)聯(lián)性,認(rèn)為游離谷氨酸含量是控制瓠瓜鮮味的一個主要因子,可以作為鑒定瓠瓜鮮味的間接度量指標(biāo)[7]。本研究以浙蒲系列瓠瓜品種為材料,利用多重PCR+高通量測序的方法,檢測了已知的16個鮮味相關(guān)SNPs和37個瓜形相關(guān)SNPs,通過數(shù)據(jù)處理、品種間SNP位點(diǎn)比較分析,旨在闡釋遺傳變異與性狀之間的關(guān)系,從而揭示浙蒲系列瓠瓜品種優(yōu)異外形與鮮味品質(zhì)的基因型基礎(chǔ),促進(jìn)更美觀和美味瓠瓜新品種的培育。
試驗(yàn)材料為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育的浙蒲系列瓠瓜品種,包括浙蒲1號、浙蒲6號、浙蒲8號、浙蒲9號以及其親本YW、Y10、I180、NXZ、G7、G11、J63。浙蒲6號于2009年育成,浙蒲8號于2015年育成,浙蒲1號和浙蒲9號是目前表現(xiàn)優(yōu)異,有望成為新品種的新組合。所有材料于2015年種植于海寧實(shí)驗(yàn)基地(30° N, 120° E)。采用人字架栽培,畦寬連溝1.6 m,雙行種植,行距75 cm,株距40 cm,每份材料種植20株。
取各品種生長2周的幼嫩葉片,液氮研磨后用DNA提取試劑盒(TIANGEN Co. Ltd, Beijing)提取其基因組DNA,具體操作方法參見試劑盒使用說明。
鮮味的度量與測定參照Wu等[7]的方法進(jìn)行。每份材料采摘商品成熟期、瓜型一致的果實(shí),每3個果實(shí)為一組,切取等質(zhì)量的(50~70 g)果實(shí)制成勻漿后放于-80 ℃保存,每份材料做3份勻漿樣品。游離氨基酸檢測時,每份勻漿樣品稱取1.5 g,加入3%的水楊酸定容至8 mL, 室溫下振蕩1 h,15 000 r·min-1離心15 min,用一次性注射器抽取上清液,過濾后用日立L-8900氨基酸自動分析儀檢測。
多重PCR反應(yīng)總體積為50 μL,主要包括2x Multiplex Buffer 25 μL,混合引物5 μL, DNA 20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共21個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳,回收目的片段,將目的片段使用TruSeq Nano DNA Library Preparation Kit,進(jìn)行高通量測序文庫構(gòu)建。使用MPprimer程序設(shè)計(jì)多重PCR引物,用于分析的16個鮮味相關(guān)SNPs位點(diǎn)序列信息來自Wu等[7],37個瓜形相關(guān)SNPs位點(diǎn)序列信息來自Xu等(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。
使用Illumina HiSeq高通量測序平臺測序,利用Illumina 分型軟件CASAVA v1.8.2 (http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/casava.ilmn) 產(chǎn)生原始數(shù)據(jù),用SeqPrep (https://github.com/jstjohn/SeqPrep) 去除接頭和引物,用Sickle (https://github.com/najoshi/sickle) 修讀以獲得高質(zhì)量凈數(shù)據(jù),然后用BWA (http://bio-bwa.sourceforge.net/) 軟件與杭州長瓜的參考序列比對,用GATK “UnifiedGenotyper”功能檢測SNPs。
浙蒲1號、浙蒲6號、浙蒲8號、浙蒲9號果實(shí)均為棒形,上下粗細(xì)較均勻,其中浙蒲6號為典型的長棒形,浙蒲8號為中長棒形,浙蒲1號和浙蒲9號果實(shí)為短棒形,各品種及其親本瓜形特征如圖1所示。為了探索浙蒲系列瓠瓜的鮮味品質(zhì),我們測定了上述4個品種及其親本的游離氨基酸含量,結(jié)果表明,浙蒲系列品種中浙蒲9號的游離谷氨酸含量最高,依次為浙蒲1號、浙蒲8號、浙蒲6號(表1),各品種之間的游離谷氨酸含量差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。浙蒲8號和浙蒲1號均有一個游離氨基酸含量較高的親本,它們的另一親本游離谷氨酸含量則一般,但雜交種鮮味表現(xiàn)較好。浙蒲9號的兩個親本游離谷氨酸含量均較高(表1)。
根據(jù)已知的16個鮮味相關(guān)SNPs位點(diǎn)和37個瓜形相關(guān)SNPs位點(diǎn)序列信息,本研究共設(shè)計(jì)了53對引物(表2)。利用這些引物對浙蒲1號、浙蒲6號、浙蒲8號、浙蒲9號及其親本進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增,獲得了各材料清晰的目標(biāo)條帶用于文庫構(gòu)建和測序(圖2)。
圖1 浙蒲系列瓠瓜及其親本瓜形特征Fig.1 The fruit shapes of Zhepu bottle gourds and their parents
表1浙蒲系列瓠瓜品種游離谷氨酸及總氨基酸含量
Table1The free Glu content and total amino acid contents in Zhepu bottle gourds
μg·g-1
空心箭頭表示目的條帶;實(shí)心箭頭表示為引物二聚體。The white arrow indicates target fragment, and the black arrow indicates the primer dimer.圖2 多重PCR擴(kuò)增電泳條帶Fig.2 The electrophoresis strip of multiplex PCR
本研究根據(jù)測序總的Reads數(shù),總測序堿基數(shù),Q20,Q30比例以及GC含量等指標(biāo)對各材料的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行了評價,其中Y10獲得的Reads數(shù)最少,只有2 553 358,浙蒲1號生成的Reads數(shù)最多,達(dá)到4 100 725,11份材料的平均Reads數(shù)為3 323 728,最小的Q20值為95.80%,最小的Q30值為87.31%,每個樣品的Map%從86.34%到88.24%不等,各材料測序的GC含量基本一致(表3)。
數(shù)據(jù)分析、SNP位點(diǎn)比對表明,測序結(jié)果覆蓋了所有的目標(biāo)SNPs。在16個鮮味相關(guān)SNPs位點(diǎn)中,有多態(tài)的有3個,分別為Chr04_4620748、Chr04_17798671、Chr09_11575954(表4);在37個瓜形相關(guān)SNPs位點(diǎn)中,有多態(tài)的有13個,分別為Chr01_10982689、Chr01_19313361、Chr01_19616760、Chr02 _16259548、Chr02_18854883、Chr05_23431366、Chr06_6104710、Chr06_6489176、Chr06_11492700、Chr06_24405893、Chr08_9459328、scaffold321_149232和scaffold321_72491(表4)。
在16個鮮味相關(guān)的SNPs位點(diǎn)上,有3個位點(diǎn)在4個品種和親本間有多態(tài),其中Chr04_4620748和Chr04_17798671在浙蒲1號及其親本間有多態(tài),Chr09_11575954在浙蒲9號及其親本間有多態(tài),其他13個位點(diǎn)在4個品種和所有親本間無多態(tài)。根據(jù)Wu等[7]對16個SNPs位點(diǎn)等位變異對游離谷氨酸含量的效應(yīng)分析,等位變異Chr04_4620748-T、Chr04_17798671-T、Chr09_11575954-A、Chr01_6938814-C、Chr05_15711773-A、Chr09_10617120-C、Scaffold136_549253-A對瓠瓜果實(shí)中游離谷氨酸含量具有增加的效應(yīng)。根據(jù)我們測得的基因型,浙蒲6號和浙蒲8號均含有4個相同的導(dǎo)致游離谷氨酸含量增加的等位變異(Chr01_6938814-C、Chr05_15711773-A、Chr09_10617120-C、Scaffold136_549253-A)。浙蒲9號還含有來自親本I180的增效等位變異Chr09_11575954-A,浙蒲1號還含有來自親本YW的另外2個增效等位變異Chr04_4620748-T和Chr04_17798671-T。我們據(jù)此認(rèn)為,上述位點(diǎn)的等位變異是上述浙蒲系列品種優(yōu)良鮮味品質(zhì)的主要來源(表4)。
在37個瓜形相關(guān)的SNPs位點(diǎn)上,有13個位點(diǎn)在4份材料和親本間出現(xiàn)多態(tài)。在位點(diǎn)Chr01_10982689上,浙蒲6號的親本G7基因型是C,NXZ基因型是T,浙蒲6號為雜合基因型,說明來自G7的等位變異對浙蒲6號的長棒瓜形有貢獻(xiàn)作用(表4)。相同的分析表明,浙蒲1號含有1個瓜形位點(diǎn)的等位變異,浙蒲6號和浙蒲8號均含有11個瓜形位點(diǎn)的等位變異,浙蒲9號含有2個瓜形位點(diǎn)的等位變異(表4),這些位點(diǎn)的等位變異均影響到上述4個品種的瓜形。
多重PCR技術(shù)是在同一反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增多個目的片段的PCR技術(shù),自1988年Chambercian等[8]提出這一概念以來,由于其高效率、低成本的特點(diǎn),在植物生物學(xué)研究中被廣泛應(yīng)用。萬映秀等[9]建立3個多重PCR體系并用于鑒定黃淮麥區(qū)主要品種品質(zhì)的相關(guān)基因。譚君等[10]利用多重PCR鑒定玉米的不同品種。陳浩東等[11]利用多重PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)對雜交棉純度的鑒定。本研究以浙蒲系列瓠瓜品種為材料,利用多重PCR的方法,檢測了已知的16個鮮味相關(guān)SNPs和37個瓜形相關(guān)SNPs,目標(biāo)SNPs檢測的覆蓋度為100%,除目標(biāo)SNPs以外,我們還檢測出了504個非目標(biāo)SNPs位點(diǎn),但是這些并不影響我們對目標(biāo)SNPs的分析,試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明多重PCR 技術(shù)已成為植物生物學(xué)研究中重要且成熟的研究手段之一。通過對影響鮮味的SNP位點(diǎn)等位變異的效應(yīng)分析,我們發(fā)現(xiàn)浙蒲1號含有6個增加游離谷氨酸含量的等位變異,浙蒲9號含有5個增加游離谷氨酸含量的等位變異,浙蒲6號和浙蒲8號含有4個增加游離谷氨酸含量的等位變異?;陴硝r味與游離氨基酸含量的相關(guān)性,我們認(rèn)為上述鮮味SNPs的增效等位變異對4個品種的鮮味形成有貢獻(xiàn)。由于鮮味的復(fù)雜性,除游離谷氨酸外其他化學(xué)物質(zhì)可能也對瓠瓜鮮味形成有影響,因此除我們檢測的SNP等位變異外,其他尚未檢測到的位點(diǎn)也有可能影響這些品種的鮮味品質(zhì)。
表2多重PCR所用的引物
Table2List of primer pairs used in multiplex PCR
染色體Chr.位置Position前引物Forwardprimer后引物Reverseprimersscaffold36421179GGAAAATCCTCAAGTAACAAGTCTTTCTCACAGATTTGAGGCCTATAAAAGGTGAGscaffold31335917ACCTGGTAGGCCTCAGTAGAACCGACGTTCTAATTTCTTAGGATTTTG-CAscaffold39072491CCATTTTCACAAACACTTTCAATCACTGGACATTGATTTCTTCCTCACAGCTAACscaffold350114296CTCTTCACAAATTGCTCGTAACAATAGCGCTTATCACTTTGGAGATTTGTCCGAscaffold3131187ATGATCAGGCTCTCCAAGGAGAAAAAATACAATACCGAGGAAGTCGAGTscaffold321149232GTTGAAATTTGCTTCAACCTTCTTAATGTCCAATTAGGTATCTCAATGGAAGGACT-GAChr02162191CCCACACCGAAAATTGTTTGTCGTCCTAAAGTAGGTGTGGAGTTGGTscaffold136549253CATTGCTCGCCATACCAGAAACTGAGGGAGAGATTGAAAAGATTGAG-GAChr031521867CCAATGACATTAAGTGCTGCAATCAGCCTAATCACAATCAAACTGCAACATGChr092837521ATGTTAGATGAAGAACAAAAGGAAGAAGGCTAACATCAACTACATGTAAAAG-TACCChr082878651GCCAATAATGAGTTCCAGGTGAGTCTTGTTGAACATCCATAGGCTTTTCAGChr044620748GCCTCTTTCATGGCTTGGGAATGGACTAAAATTCCTTTCGTTTGCGTChr104689037TTGCCCTGTTCATTTTGATGTCTAATGGATATTAGAAGTGTAGGTGTCCCA-CATTChr105448266TTTTCAATAGCTTTGCCAATCCAAAATCACATCACAAAAACATTGTTCGACTAT-TCChr095490094CCCAAAATTCAAGAAACAGATCTTAGAGAGGACAGGTGACCATTTTTCATTA-AGACTChr066104710CTTTGCTGGAGCAGATTTCACACAGTAAGGTTTGCGCTTAATTCAT-TCTTTTChr066301522GCTGAGGATCCGAATGCTGTTACGGCTGGTCTGATCCAAATTAACAChr066489176GATGCAACCCATTGTAAGAAAATGTAAGAAAAAATTAATTGGTTATCAGACG-GCTCTChr066828063TTGCATGGTGTTTCAATTACACATGTAAACTGCGAGTATGGTAGTGATAGTGCChr076884662GGCCATGGACACGGTAAAAATTATGGAATTAGGCAAAGCAGAAGAATTCACAChr016938814AGCAGCTGACCGTCATCTTAACCAAGGTTAAAACGGTAATTTGACCCAChr019104188CTACTTCTACCTATGGGTTTCCTTGTTTATCCCACCTAGTTGAGATTTCCTCT-TATChr059266893TCTTTGATACCAGTAGCGAGGTGATAGTTCACACAAAAATAGGGTATTGAC-TAChr089459328GCACCCACAAACACACTAAGAAATGACCATGCATTAACTTAGGCATTGGAChr0810100436CAGTATTGGCTAGTCTCATGAATCATCACCCACTCTCTCATTGACTTGAGAGTChr0910617120CTGCTTGATGAGACTTACATTTAACTAGGCCCTTCTCTAGCCAGTGAGAGAChr0910672327TTTAAACAAAGTTACAGTTCGCAACAAGTCCACAAACTGATCTAGGTATTCGT-GAAAChr0110729456CATAAATGGATCGATTCAGCTTGAAAACTGTACAAACATTTAAAGCTCGACTTG-TAGChr0110982689TCAGGTCTCGTTTGATGTCAGTGCCATCTAGATGAGGATGTAGTTGACGAChr0611492700TGTCATGGAAACAAAGCCTTGTTATAAGAGCTGATGAATTCTTAGGAAACTTTT-GCCChr0911563939GGCCCAAGTTTCCGACTCAATAGTCCAACCATAAACTAAGTCCCGATChr0911575954TTTAAGAGAACGGATTCTCAGGAAAAGACTCTGATGGGTTGTACATCTGCATChr0511924571CCAGGGACCGCATAGTTTTGAACGTCTCTCTCTTCCAATTCTGCTTTGChr0911955078CTCCTGTTTCTTCGGGATTATCCTTATGCCTCGAATGAATAATTGGTTTGT-GATCCChr0112052259ACCAGCTTGCAAGTCAGCTAAACCAAATGCGGTGTCTACACCTTChr0612227669CGGTGACTGCAGAACAAGACTTTGAATGGTCAATGGAACAAACT-GTTTTGChr0513270218TACCCTTACTTACATGTCTCCTCATGAAACAGCGATTCCTAAATAATTAAAT-GAGGChr0213566931GAAACTTTTAGCCACGTTCACTTGTCTTCAGAAAAGCGTGGGCAAATChr0213570856AGTTCGTGTATCTTGTAAGGATCAAATCCATTTGTCTAAGGAACAGTATCCTA-AGATChr0514197095TCTCCAATATCAATTGTCGATGATTGCTGGTTGGTTGATTATGTGCATAATGT-CATChr1114707964ACTTTGCAATCGTTACAAACGATGTCCCAAAATGACAGGCTAATTGAGTCChr0515711773TAGGATGATCATAGGTGACTTGACCTTTCCTCATTGTTCAAGACCTGGCATTAChr0216172329TTTTTGGAGACAGATTCAGAATATTCTGTGATCTTGATCATCAAGGTAAATTC-CTCTChr0216259548GATACTTGTTGGACGGTCCCTTTTCTATGATCATCGAGCCATCATATCA-GAChr0417798671TGTTACATTTGGTTGGCCTCCTTTTCACTATTGCCATAGCTGAGAATTCAGChr0218854883GAACTCTTGCATGACTTTTATCCCAATTCCGCTCTGAAGATTCACCAGGAAAAATChr0119313361AGAGGTGTTGACCGAAATGTGTGCCAACTTATCTTTAGGTTGAAACTT-GGChr0119616760AATCATAATTACCTTGAGGTGAAAGCGAGAAGCCATGTGGCAGAATTTGGChr1020175179ACGTGGATGTTTGTCATTAATTTGCCTTCCCAACCAAAAGGTTTCAAATGAT-TAChr0220541964TACCTCCTTAAGCATCACTAATCCCTTGCTTGTGAGGGCAATACTTTGATTChr0523431366TCGGGAATGTTCTGATTGCAGTTCTTTGAAAGGATTTACAAG-GAGTTTCAChr0624405893TGAAAATATAGAAAAGAAGGCAGTGATGTTTTTCGCATTTCTTATCTTCTACGGTTChr0536980374CCATGGGAGTGAAGATTCCAACAGGCTGATGATATTCCCAGTAATCA-CATT
表3多重PCR測序
Table3Sequencing data statistics of multiple PCR products
樣品總Reads總堿基數(shù)Q20/%Q30/%GC/%對應(yīng)Reads數(shù)對應(yīng)率SampleTotalReadsTotalbasesMappedReadsMappedrate/%浙蒲1號ZhepuNo.1410072557525112996.1687.9441.6932919740.879浙蒲6號ZhepuNo.6341212147497729995.8587.5141.2526049550.863浙蒲8號ZhepuNo.8319666444309801695.8187.4941.5924254270.878浙蒲9號ZhepuNo.9307581643155653195.9487.5241.6524647720.882I180384880953452008895.8187.541.6828660930.869G11348482449026158596.3388.3141.3528036840.874G7351996849206290595.8287.3441.6827102050.878NXZ341023747863019296.1087.8041.6027179330.875Y10255335836081462295.9787.4441.7320401660.869YW306272442760950995.8087.3141.6723489710.867J63289576540752272296.0387.5641.6223183580.875
表4不同品種及親本中鮮味和瓜形貢獻(xiàn)SNP分布情況
Table4Distribution of umami taste and fruit shape related SNPs in various cultivars and their parents
項(xiàng)目ItemCHRPOSSNP浙蒲1號ZhepuNo.1浙蒲6號ZhepuNo.6浙蒲8號ZhepuNo.8浙蒲9號ZhepuNo.9I180G11G7NXZY10YWJ63增效等位變異SAV1)增效值Synergis-ticvalue鮮味UmamiChr044620748C/TYCCCCCCCCTCT69.13tasteChr0417798671C/TYCCCCCCCCTCT136.88Chr0911575954G/AGGGRAGGGGGGA80.4Chr016938814C/TCCCCCCCCCCCC36.77Chr0515711773A/GAAAAAAAAAAAA25.84Chr0910617120C/ACCCCCCCCCCCC47.01scaffold136549253A/GAAAAAAAAAAAA48.65瓜形FruitChr0110982689C/TCYYYCTCTCCTshapeChr0119313361A/GRAARGAAAAGAChr0119616760A/CCMMCCCACCCCChr0216259548T/CTTTTTTTCTTTChr0218854883A/CCMMCCCACCCCChr0523431366C/TTYYTTTCTTTTChr066104710A/TTWWTTTATTTTChr066489176G/TTGKTTGGTTTTChr0611492700A/TTWWTTTATTTTChr0624405893G/AARRAAAGAAAAChr089459328A/CCMMCCCACCCCscaffold321149232A/GGRRGGGAGGGGscaffold39072491A/GGRRGGGAGGGG
1) SAV, Synergistic allele variation.
通過瓜形優(yōu)異性狀和有利等位型的一致性分析,我們發(fā)現(xiàn)短棒品種浙蒲1號和浙蒲9號只含有1~2個影響瓜長的位點(diǎn)變異,而中長棒品種浙蒲6號和浙蒲8號則含有11個影響瓜長的等位變異,品種攜帶的瓜長位點(diǎn)等位變異數(shù)目與其瓜形長度呈正相關(guān),說明這些位點(diǎn)對4個品種的瓜形有重要的貢獻(xiàn)。在Chr02_16259548上,親本之間存在多態(tài),雜交個體卻是非雜合的基因型,說明此SNP位點(diǎn)可能是一個假陽性位點(diǎn)。對于其他的沒有多態(tài)性的瓜形相關(guān)SNPs位點(diǎn),親本和雜交品種都是純合且一致的,說明這些位點(diǎn)可能在這些材料的瓜形上不貢獻(xiàn)或者同時貢獻(xiàn)。本研究以浙蒲系列瓠瓜品種為材料,利用多重PCR的方法,檢測了已知的16個鮮味相關(guān)SNPs和37個瓜形相關(guān)SNPs,鑒定出浙蒲1號、浙蒲6號、浙蒲8號、浙蒲9號中可能對其鮮味品質(zhì)和優(yōu)美瓜形形成有突出貢獻(xiàn)的有利等位變異,初步揭示了浙蒲系列瓠瓜品種優(yōu)異外形與鮮味品質(zhì)的基因型基礎(chǔ),為未來瓠瓜優(yōu)美瓜形和鮮味品質(zhì)分子育種工作奠定了基礎(chǔ)。
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