哇巴因?qū)θ橄侔㎝CF7細(xì)胞能量代謝的影響研究

申佳佳，占躍晨，王燕，李會(huì)英，蔣建東，王真

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哇巴因?qū)θ橄侔㎝CF7細(xì)胞能量代謝的影響研究

申佳佳，占躍晨，王燕，李會(huì)英，蔣建東，王真

100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所（申佳佳、占躍晨、李會(huì)英、蔣建東、王真）；100050 北京，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所（王燕、蔣建東）

檢測(cè)哇巴因?qū)θ巳橄侔?MCF7 細(xì)胞能量代謝的影響，初步探索相關(guān)作用機(jī)制。

聯(lián)合使用 ATP 檢測(cè)系統(tǒng)及海馬生化分析儀檢測(cè)哇巴因作用后細(xì)胞內(nèi)ATP 水平及線粒體呼吸作用的變化；使用葡萄糖氧化酶法檢測(cè)哇巴因?qū)?MCF7 細(xì)胞葡萄糖吸收水平的影響；使用 AMPK 活性檢測(cè)探針檢測(cè) AMPK 活性的變化；通過 Western blot 實(shí)驗(yàn)初步檢測(cè)哇巴因?qū)?MCF7 細(xì)胞內(nèi)相關(guān)激酶蛋白水平的影響。

哇巴因能夠時(shí)間依賴性地降低 MCF7 細(xì)胞內(nèi) ATP 水平，劑量依賴性地降低線粒體呼吸作用，同時(shí) 25 ~50 nmol/L 的哇巴因作用 24 h 后能夠促進(jìn)葡萄糖吸收。該化合物可激活 AMPK 活性，在 12 h 表現(xiàn)出最佳活性。Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)哇巴因能夠升高 AMPK 和底物蛋白乙酰輔酶 A 羧化酶（ACC）的磷酸化水平，抑制 Na+/K+-ATP 酶 α1 亞型（NKAα1）的表達(dá)。

哇巴因可抑制人乳腺癌 MCF7 細(xì)胞的線粒體氧化呼吸作用，促進(jìn)糖酵解。哇巴因?qū)δ[瘤代謝的影響可能與其調(diào)控 AMPK 活性有關(guān)。

哇巴因； 糖酵解； 乳腺癌細(xì)胞； 線粒體氧化呼吸

洋地黃類藥物作為細(xì)胞內(nèi) Na+/K+-ATP 酶（NKA）的特異性配體，在臨床上廣泛應(yīng)用于心力衰竭和心律失常的治療[1]。研究發(fā)現(xiàn)，洋地黃類藥物還可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[2]，長(zhǎng)期服用洋地黃類藥物能夠抑制腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[3]。哇巴因（ouabain，OUA）作為洋地黃類藥物家族成員之一，不僅可以通過激活 NKA，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放，激活心肌細(xì)胞代謝系統(tǒng)[4]，還能夠通過抑制 DNA 拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性以及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及凋亡等，降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力和細(xì)胞遷移能力[5-7]。另有研究發(fā)現(xiàn)，哇巴因能夠拮抗雌激素受體，抑制乳腺癌細(xì)胞 MDA-MB-231 增殖[8]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，哇巴因和地高辛可通過激活 AMPK/mTOR 和 Src/ERK1/2 雙重信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡[9-10]，本文擬從調(diào)控腫瘤細(xì)胞代謝的角度探索哇巴因的抗腫瘤活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及其處理 哇巴因（O3125）購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司，采用 DMSO 配制成 10 mmol/L 儲(chǔ)備液；阿卡地新（AICAR，sc-200659）購(gòu)自美國(guó) Santa Cruz 公司，采用 DMSO 配制成 100 mmol/L 儲(chǔ)備液。本文中涉及的藥物處理均在細(xì)胞貼壁后 18 ~ 24 h 后進(jìn)行，用藥濃度如下：哇巴因，10、25 及50 nmol/L；AICAR，0.5 mmol/L。

1.1.2 儀器和試劑 Model3131 細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Thermo Scientific 公司；CKX41 倒置顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus 公司；AVC-3D1 垂直流超凈臺(tái)購(gòu)自新加坡 ESCO 公司；165-8001 蛋白垂直電泳儀、170-3940 蛋白半干轉(zhuǎn)膜儀及 Model680 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；Chemilmager5500 凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó) Alpha innotech 公司；XFe24 海馬生化分析儀購(gòu)自 Seahorse 公司；胎牛血清（FBS，0099-141）、0.25% 胰蛋白酶（25200-072）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)液和細(xì)胞培養(yǎng)用磷酸鹽緩沖液（PBS）均購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；ATPliteTM發(fā)光分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Perkin Elmer 公司；AMPK 體外活性試劑盒（CY-1182）購(gòu)自日本MBL 公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒（GS121T）購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司；抗β-actin（A1978）抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；抗p-AMPKα（2535）、AMPKα（2532）、Na+/K+-ATPase（3010）、p-ACC（3661）和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔二抗（7074）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；HRP 標(biāo)記羊抗小鼠二抗（ZB2305）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；HRP 化學(xué)發(fā)光試劑盒（WBKLS0100）購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 AMPK 體外活性實(shí)驗(yàn) 使用藥物處理細(xì)胞至指定時(shí)間后，采用 AMPK 體外活性試劑盒檢測(cè) AMPK 活性，加入 1 μg/10 μl 蛋白液于底物板中，加入 90 μl 激酶反應(yīng)緩沖液，避光置于 30 ℃恒溫孵育 30 min。之后按序分別加入 100 μl 抗 p-IRS-1（S789）單克隆抗體（AS-4C4）及 100 μl 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠二抗，每次加入后需避光室溫孵育 30 min，漂洗 3 次。最后加入 100 μl 反應(yīng)終止液，用酶標(biāo)儀于 450 nm 處測(cè)定吸光度值（），以加入等體積 DMSO 溶液的對(duì)照組細(xì)胞為100%，計(jì)算 AMPK 相對(duì)活性。

相對(duì)活性（%）=A給藥組–A空白組× 100% A對(duì)照組–A空白組

1.2.2 細(xì)胞內(nèi)線粒體活性檢測(cè) 細(xì)胞接種于24 孔海馬生化分析儀細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h 后加不同濃度的哇巴因處理至指點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)，空白組加入等體積的 DMSO 溶液，之后按照操作說(shuō)明分別加入 1.5 μmol/L 的寡霉素，1.0 μmol/L 的線粒體解偶聯(lián)劑 FCCP，0.5 μmol/L 的抗霉素以及 1.5 μmol/L 的魚藤酮，生化分析儀檢測(cè)線粒體的不同功能，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi) ATP 水平檢測(cè) 細(xì)胞接種于 96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h 后加藥處理至指點(diǎn)時(shí)間點(diǎn)。采用 ATPliteTM發(fā)光分析系統(tǒng)檢測(cè) ATP 水平。以加入等體積的 DMSO 溶液的對(duì)照組細(xì)胞為 100%，計(jì)算相對(duì) ATP 水平。

相對(duì) ATP 水平（%）=實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度× 100% 對(duì)照組熒光強(qiáng)度

1.2.4 葡萄糖吸收水平檢測(cè) 細(xì)胞接種于 12 孔板中培養(yǎng) 24 h 后使用不同濃度的哇巴因或 DMSO溶液處理 24 h，采用葡萄糖測(cè)定試劑盒（葡萄糖氧化酶法）檢測(cè)葡萄糖吸收水平。向 96 孔板中加入 198 μl 檢測(cè)試劑及 2 μl 細(xì)胞培養(yǎng)上清，37 ℃孵育10 min，在酶標(biāo)儀 490 nm 波長(zhǎng)處讀取吸光度值，以試劑空白調(diào)零，同時(shí)以未接種細(xì)胞的空白孔的糖含量作為基礎(chǔ)值，計(jì)算各孔細(xì)胞的葡萄糖相對(duì)吸收量。

1.2.5 Western blot 細(xì)胞接種于 60 mm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng) 24 h 后使用哇巴因或等體積的 DMSO 溶液處理至指定時(shí)間，裂解細(xì)胞，進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳及半干法轉(zhuǎn)膜。將膜置于含 5%脫脂奶粉的 TBS-T 中室溫封閉 1 h 后，加入一抗在室溫下孵育 1 h 或 4 ℃搖床過夜，加入相應(yīng)的二抗在室溫下孵育 1 h，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白，按照 HRP 化學(xué)發(fā)光試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行顯色，通過凝膠成像儀捕獲圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 哇巴因?qū)?xì)胞內(nèi) ATP 水平的影響

為了檢測(cè)哇巴因?qū)θ橄侔?MCF7 細(xì)胞能量代謝水平的調(diào)控作用，我們首先檢測(cè)哇巴因?qū)?xì)胞內(nèi)ATP 水平的影響，以 25 nmol/L 哇巴因處理 MCF7 細(xì)胞至不同時(shí)間點(diǎn)（2、6、12 和 24 h）后發(fā)現(xiàn)，哇巴因能引起細(xì)胞內(nèi) ATP 水平顯著降低，并呈現(xiàn)明顯的時(shí)間依賴性（圖 1）。

圖 1 不同時(shí)間哇巴因?qū)?xì)胞內(nèi)ATP 水平的影響（***P < 0.001）

Figure 1 Effect of ouabain on intracellular ATP levels for the indicated time (***< 0.001)

2.2 哇巴因?qū)?xì)胞內(nèi)線粒體呼吸作用的影響

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)能量產(chǎn)生的主要場(chǎng)所，我們接著檢測(cè)了哇巴因?qū)?MCF7 細(xì)胞內(nèi)線粒體活性的影響。使用海馬生化分析儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的哇巴因?qū)€粒體的基礎(chǔ)呼吸作用、ATP 合成能力、線粒體潛在呼吸作用均有顯著抑制作用，且哇巴因?qū)€粒體功能的抑制作用表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。此外，高濃度的哇巴因?qū)Ψ蔷€粒體呼吸作用也有抑制作用（圖 2）。

圖 2 哇巴因?qū)CF7 細(xì)胞線粒體呼吸作用的影響（**P < 0.01）（A：基礎(chǔ)呼吸作用；B：ATP合成；C：潛在呼吸作用；D：非線粒體呼吸作用）

Figure 2 Effect of ouabain on mitochondrial respiration (**< 0.01) (A: Basal respiration; B: ATP production; C: Sqare capacity; D: Non-mitochondrial respiration)

2.3 哇巴因?qū)?xì)胞葡萄糖吸收的影響

哇巴因抑制線粒體的有氧呼吸作用，可能會(huì)促進(jìn)糖酵解。我們接著檢測(cè)了哇巴因?qū)Ψ从程墙徒獾闹笜?biāo)之一——葡萄糖吸收水平的影響。如圖 3所示，哇巴因處理 MCF7 細(xì)胞 24 h 后，可促進(jìn)葡萄糖吸收，其中 25 nmol/L 劑量作用顯著。

圖 3 哇巴因?qū)CF7 細(xì)胞葡萄糖吸收水平的影響（*P < 0.05）

Figure 3 Effect of ouabain on the glucose consumption level after treatment for 24 h (*< 0.05)

2.4 AMPK 體外活性實(shí)驗(yàn)

AMPK 是細(xì)胞內(nèi)重要的能量感受器，細(xì)胞內(nèi) ATP 合成被抑制或者 ATP 的消耗增加均能夠激活 AMPK[11]。接著我們檢測(cè)了藥物處理后對(duì)體外 AMPK 活性的影響。AICAR 是一種廣泛使用的 AMPK 激活劑，能在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)換為一磷酸腺苷（AMP）類似物 ZMP 從而激活 AMPK[12]。在本研究中，以 0.5 mmol/L AICAR 處理 MCF-7 細(xì)胞 0.5 h 作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以 25 nmol/L 哇巴因處理細(xì)胞至不同時(shí)間點(diǎn)（1、2、6、12、24 和 48 h），結(jié)果顯示，哇巴因能顯著上調(diào)體外 AMPK 活性，并且在 12 h 內(nèi)對(duì) AMPK 的激活呈時(shí)間依賴性（圖 4）。

2.5 哇巴因?qū)?AMPK 信號(hào)通路的影響

進(jìn)一步通過 Western blot 檢測(cè)了哇巴因?qū)?AMPK 磷酸化活性和下游信號(hào)的影響。使用25 nmol/L 哇巴因處理 MCF7 細(xì)胞一定時(shí)間后發(fā)現(xiàn)，AMPK 磷酸化水平升高，其下游底物蛋白 ACC 也被活化，進(jìn)一步說(shuō)明 AMPK 活性顯著上調(diào)（圖 5）。曾有文獻(xiàn)報(bào)道，NKA 作為洋地黃類藥物的直接受體，在與藥物結(jié)合后，介導(dǎo)下游信號(hào)通路的活化[13]。因此，我們還檢測(cè)了藥物處理后 NKAα1 表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，NKAα1 蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)，并且這一過程與 AMPK 活化基本同步（圖 5）。

圖 4 哇巴因?qū)w外AMPK 活性的影響（*P < 0.05；**P < 0.01）

Figure 4 Effect of ouabain on the activity of AMPK(*< 0.05;**< 0.01)

圖 5 哇巴因?qū)MPK 信號(hào)通路的影響

Figure 5 Effect of ouabain on AMPK pathway

3 討論

腫瘤細(xì)胞具有異常的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，其細(xì)胞內(nèi)能量代謝途徑的變化對(duì)于維持腫瘤細(xì)胞功能發(fā)揮著重要作用。已證實(shí)，腫瘤細(xì)胞可將能量代謝過程從線粒體氧化磷酸化途徑轉(zhuǎn)變成糖酵解途徑（Warburg 效應(yīng)），細(xì)胞新陳代謝率及葡萄糖攝取能力均顯著提高，維持其異常的增殖能力[14]。同時(shí)，在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，線粒體氧化磷酸化反應(yīng)依然在進(jìn)行，為生物大分子的合成提供能量[15]，因此，通過降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的氧化磷酸化或糖酵解水平，達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的能力，成為抗腫瘤藥物的研究方向之一。近有研究發(fā)現(xiàn)，廣泛應(yīng)用于糖尿病治療的二甲雙胍通過抑制腫瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)電子轉(zhuǎn)移鏈的活性，抑制氧化磷酸化反應(yīng)及 ATP 的產(chǎn)生，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，哇巴因能夠顯著降低人乳腺癌 MCF7 細(xì)胞中的 ATP 水平，該 ATP 水平的降低與哇巴因抑制線粒體的有氧呼吸功能有關(guān)。哇巴因同時(shí)促進(jìn)葡萄糖吸收，提示其可能促進(jìn)糖酵解。

AMPK 是細(xì)胞內(nèi)重要的能量感受器，在細(xì)胞新陳代謝及腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞內(nèi) AMP/ATP 比例的上調(diào)能直接激活 AMPK 活性，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、自噬及凋亡等過程[17]。由于多種腫瘤細(xì)胞均存在能量代謝異常[18-19]，通過激活 AMPK 進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的能量代謝水平成為腫瘤抑制藥物的研究方向之一，如二甲雙胍、多種黃酮類及多酚類天然產(chǎn)物均能夠通過激活 AMPK 發(fā)揮腫瘤抑制作用[20]。另有研究表明，AMPK 活化也可促使腫瘤代謝從氧化磷酸化轉(zhuǎn)為糖酵解[21-23]。我們的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，哇巴因能夠激活 AMPK 信號(hào)通路，抑制氧化磷酸化，誘導(dǎo)糖酵解，提示其對(duì)上述腫瘤代謝的影響與 AMPK 活性有關(guān)。結(jié)合我們前期發(fā)表的工作，本研究進(jìn)一步證實(shí)AMPK 信號(hào)在哇巴因的抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮重要作用。我們還發(fā)現(xiàn) NKAα1 蛋白表達(dá)水平同時(shí)出現(xiàn)下調(diào)，該受體可能參與對(duì) AMPK 信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

綜上，本研究證實(shí)，哇巴因可抑制乳腺癌 MCF7 細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化呼吸作用，促進(jìn)糖酵解；該作用與 AMPK 的磷酸化激活有關(guān)。本工作首次研究了哇巴因?qū)δ[瘤代謝的影響，為該類化合物的抗腫瘤機(jī)制提供了有意義的補(bǔ)充。

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Effect of ouabain on energy metabolism in MCF7 cells

SHEN Jia-jia, ZHAN Yue-chen, WANG Yan, LI Hui-ying, JIANG Jian-dong, WANG Zhen

Author Affiliations: Institute of Medicinal Biotechnology (SHEN Jia-jia, ZHAN Yue-chen, LI Hui-ying, JIANG Jian-dong, WANG Zhen), Institute of Materia Medica (WANG Yan, JIANG Jian-dong), Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To explore the effect of ouabain on energy metabolism in MCF7 breast cancer cells.

ATP assay and seahorse bioanalyzer were used to detect the changes of ATP level and mitochondrial respirational function, respectively, after treatment with ouabain. Glucose concentration was measured by glucose oxidase to detect the regulation of ouabain on the glucose consumption in MCF7 cells. AMPK Assay Kit was used to detect theactivity of AMPK, and Western blot was used to test the regulation of ouabain on the protein level of correlated kinases in MCF7 cells.

Ouabain of 25 nmol/L decreased the ATP level time-dependently. The compound significantly reduced the mitochondrial respiration function in a dose-dependent manner within 48 h in MCF cells. Increase of glucose consumption was observed by ouabain (25 - 50 nmol/L) treatment for 24 h. Activation of AMPK was increased upon ouabain treatment, reaching maximal effect at 12 h. Activation of AMPK signaling pathway and decrease of Na+/K+-ATPaseα1 subtype (NKAα1) expression were observed after exposure to ouabain.

Ouabain inhibits the oxidative respiration of mitochondria, and induces glycolysis reducing in MCF7 cells. The shifting of energy metabolism may result from the activation of AMPK upon the compound treatment.

Ouabain; Glycolysis; Breast cancer cells; Mitochondrial respiration

WANG Zhen, Email: wangzhen@imb.pumc.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金（81373438、81402974）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程（2016-I2M-2-002）

王真，Email：wangzhen@imb.pumc.edu.cn

2017-12-08

10.3969/j.issn.1673-713X.2018.01.005