實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在淋球菌檢測中的應(yīng)用分析

苗文靜　安玉志　孫文文

[摘要] 目的 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法評價(jià)實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（SAT）在臨床淋球菌檢測中的應(yīng)用。 方法 以淋球菌培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)對照，采用實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)同時(shí)對150例疑似患者的生殖道拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，并用PCR法進(jìn)行驗(yàn)證。 結(jié)果 使用SAT檢測的生殖道拭子和尿液陽性檢出均為110例，培養(yǎng)法陽性檢出為108例，其中培養(yǎng)法檢出陰性的2例通過PCR驗(yàn)證為陽性。兩種取樣方式的SAT檢測法和培養(yǎng)法三者陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT 檢測拭子的敏感度為100.0%，特異度為95.2%;SAT檢測尿液標(biāo)本的敏感度為100.0%，特異度為 95.2%。 結(jié)論 采用實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對生殖道拭子和尿道標(biāo)本的檢測效果與培養(yǎng)法相比，陽性率高，敏感度較高，且尿道標(biāo)本收集方法比較簡便，患者依從性好，可代替拭子道取樣方法，此方法可在臨床推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 淋球菌;熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù);尿液

[中圖分類號] R446? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2018）34-0120-04

熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（simultaneous amplification and testing，SAT）是新型核酸（RNA）檢測技術(shù)，它把核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光檢測相結(jié)合，采用磁珠法特異性提取目標(biāo)RNA，為提高提取效率，采用高速離心、高溫加熱技術(shù)，并且目標(biāo) RNA 提取過程中不易降解，交叉污染幾率變小[1-2]，與傳統(tǒng)方法相比，降低污染引起的假陽性幾率。這項(xiàng)技術(shù)也被應(yīng)用于結(jié)核桿菌、沙眼衣原體、解脲脲原體等多種疾病的診斷[3-5]。

本文采用SAT技術(shù)同時(shí)對疑似患者的生殖道拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本進(jìn)行檢測，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，與傳統(tǒng)的淋球菌培養(yǎng)法進(jìn)行比較，并采用臨床常用的PCR法驗(yàn)證，然后以培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，比較敏感度和特異度，評價(jià)其在臨床上應(yīng)用的可行性。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑

淋球菌分離培養(yǎng)基購自珠海銀科醫(yī)學(xué)工程公司。PCR試劑盒由深圳匹基生物工程有限公司提供，SAT法恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒（NG-SAT）由上海仁度生物提供。生物安全柜（Thermo Fisher1300）;全自動核酸提取儀（AB Mag MAXTM Express 96）;高壓滅菌鍋（廈門致微GR85DR）;生化培養(yǎng)箱（廣東環(huán)凱SP250）;Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（Roche 公司）。

1.2 樣本來源

來本院就診的疑似病例150例，其中男80例，女70例，年齡28～65歲?；颊呔芍髦吾t(yī)師檢查，并詢問其生活狀況確定為疑似病例。樣品采集均用編號以保證病人隱私，患者涉及到不同地區(qū)、患病或不患病人群，具有地區(qū)與人群代表性，并征求患者同意。對每例患者分別采集3份生殖道拭子標(biāo)本和1份尿液標(biāo)本。

1.3 樣本采集方法

1.3.1 生殖道拭子標(biāo)本采集? 男性患者用無菌鹽水沖洗尿道口多次，在尿道1～2 cm處;女性患者清除陰道宮頸口的分泌物后，在宮頸口2～3 cm處插入無菌棉拭子采集樣本，注意抽出拭子時(shí)要避免與陰道壁接觸，然后置無菌試管內(nèi)快速送檢接種。要求所有患者在采集標(biāo)本前1周均不能使用抗生素治療。第1支拭子用于淋球菌培養(yǎng);第2支拭子用0.9%生理鹽水1.5 mL洗脫，取1 mL洗脫液至專用尿液保存液中（試劑盒提供），混勻后，-20℃冰箱保存，備用于 SAT 檢測;第3支拭子用0.9%生理鹽水1 mL洗脫，-20℃冰箱保存，備用于PCR檢測。

1.3.2 尿液標(biāo)本采集? 初段尿1 mL與1 mL尿液保存液（SAT試劑盒提供）混合置于EP管中，在-20℃冷凍儲存，備用于SAT檢測。

1.4 檢測方法

1.4.1 淋球菌培養(yǎng)法? 生殖道拭子標(biāo)本采集后立即送檢，1 h內(nèi)接種，嚴(yán)格遵照試劑說明書進(jìn)行操作及結(jié)果判定。

1.4.2 SAT檢測? 將備用保存的拭子洗脫液從冰箱取出平衡至室溫，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行，將400 μL含有尿樣保存液的尿液樣本與100 μL核酸提取液均勻混合，在60℃恒溫 5 min后，室溫放置 10 min，轉(zhuǎn)移至半自動核酸提取儀上進(jìn)行分離提取，核酸 RNA 提取完成以后，定量吸取 30 μL含磁珠的擴(kuò)增檢測液至微量反應(yīng)管，預(yù)熱后加酶，在同一溫度下（42℃），用RNA作為起始模板，通過 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生一個(gè)雙鏈DNA拷貝，然后利用 T7-RNA多聚酶從該DNA拷貝產(chǎn)生出100～1000個(gè)RNA拷貝;每個(gè)RNA 拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)帶，最后轉(zhuǎn)至 Light Cycler 480熒光定量PCR儀中啟動反應(yīng)程序。反應(yīng)程序：熒光標(biāo)記選擇羧基熒光素，42℃保持1 min，共40個(gè)循環(huán);每分鐘收集1次熒光信號，共檢測 40 次，記錄數(shù)據(jù)。

1.4.3 PCR法檢測? 將備用保存的拭子洗脫液從冰箱取出平衡至室溫，嚴(yán)格遵照試劑說明書按照操作及結(jié)果判定進(jìn)行檢測。

1.5 判定標(biāo)準(zhǔn)

以淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)SAT 法的靈敏度、特異性。根據(jù)方法確認(rèn)性能指標(biāo)要求[6]：靈敏度≥98%，特異性≥90.4%進(jìn)行判定，見表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，并進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SAT法檢測結(jié)果

采用SAT法檢測，150例疑似患者中，生殖道拭子標(biāo)本檢出陽性110例，尿液標(biāo)本檢出陽性110例，淋球菌培養(yǎng)法檢出108例，其中2例用SAT 法檢測均為陽性，而淋球菌培養(yǎng)法檢測為陰性，用PCR法進(jìn)行驗(yàn)證后為陽性。符合率100%。兩種取樣方式的SAT檢測法和培養(yǎng)法三者陽性率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見表2。

2.2 SAT檢測靈敏度和特異度計(jì)算

根據(jù)1.5項(xiàng)下統(tǒng)計(jì)方法，對檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)得出SAT法與國標(biāo)法陰陽性結(jié)果，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。同時(shí)使用淋球菌培養(yǎng)和 NG-SAT 檢測150 例，以淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT檢測生殖道拭子靈敏度為 100.0%，特異度為95.2%;SAT 檢測尿液靈敏度為 100.0%，特異度為95.2%。

3 討論

淋病的病原體是奈瑟氏淋球菌，唯一宿主是人類[7]。淋病的臨床表現(xiàn)多見于尿道炎及宮頸炎，典型的癥狀為：尿頻、尿急、尿痛、排尿困難及排出黏液或膿性分泌物等。此外病菌還可能侵犯到眼睛、咽部、直腸以及盆腔等處，通過血液播散感染進(jìn)而引發(fā)關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、敗血癥等疾病。在全國流行病學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，其在性病病種構(gòu)成比中占比較大，所占排名比較靠前[8]。淋球菌感染所致的淋病在我國是發(fā)病率較高的性傳播疾病，并每年呈上升的趨勢，2018年僅4月份全國報(bào)告淋病達(dá)1萬多例[9]，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人民群眾的身心健康，成為重要的公共衛(wèi)生問題[10]。

淋球菌作為人體的寄生菌多存在于人體的陰道炎和急性尿道炎的膿性分泌物中，是造成尿道炎和陰道炎的常見菌，所以準(zhǔn)確、快速的檢測出淋球菌對早期診斷淋球菌性尿道炎和陰道炎具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[11]。目前臨床上淋球菌的檢測方法有3種：淋球菌培養(yǎng)法、PCR檢測法和新型的SAT檢測法。傳統(tǒng)檢測方法在敏感性和特異性上都有各自的不足之處。淋球菌培養(yǎng)法敏感性稍差，而PCR法的敏感性較高，對采集標(biāo)本的要求也沒有那么嚴(yán)格，但是PCR不能區(qū)分出病原體是死菌還是活菌，不適合用于判愈，因?yàn)榛颊呓?jīng)臨床治療后病菌死亡或者癥狀消失即判為治愈，如果要等PCR法檢測為陰性，體內(nèi)死菌全部排完，勢必造成過度治療[12，13]，另外，生殖道拭子標(biāo)本中DNA消失的時(shí)間為6～9 d[14]，臨床已治愈的患者此期內(nèi)PCR檢測仍可出現(xiàn)假陽性。本文對新型的SAT檢測進(jìn)行研究，得到的結(jié)論具有臨床意義。

本文采用的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（SAT），檢測研究表明，相同患者的生殖道拭子標(biāo)本和尿液標(biāo)本同時(shí)利用SAT檢測，結(jié)果與淋球菌培養(yǎng)法結(jié)果完全一致，并通過PCR法驗(yàn)證，表明使用SAT檢測法檢測尿液標(biāo)本可以代替檢測生殖道拭子標(biāo)本，這樣可以提高對侵入取樣敏感人群的依從性，能夠增加一些攜帶者被及時(shí)診斷及時(shí)治療的機(jī)會，相應(yīng)減少潛在傳染的幾率。雖然尿液標(biāo)本中的雜菌數(shù)量很高或者血尿和蛋白尿時(shí)會引起假陽性[15]，但是應(yīng)用SAT法可以幫助而且快速辨別假陽性避免漏檢，對于疑似病例的早期診斷具有重要臨床意義[16]。以淋球菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，SAT 檢測生殖道拭子敏感性為 100.0%，特異性為95.2%;SAT 檢測尿液標(biāo)本敏感性為100.0%，特異性為95.2%，數(shù)據(jù)結(jié)果表明敏感性和特異性均較高且一致。在150例疑似病例標(biāo)本中有2例同一患者生殖道拭子和尿液標(biāo)本SAT檢測均為陽性，而淋球菌培養(yǎng)為陰性，這2例標(biāo)本經(jīng)PCR檢測法驗(yàn)證后為陽性，這可能是因?yàn)榱芮蚓囵B(yǎng)耗時(shí)長，容易造成尿道感染的女性患者漏檢[17，18]，可能是因?yàn)榱芮蚓囵B(yǎng)法敏感性不高所致，也說明SAT 檢測法的高靈敏性。

本研究結(jié)果顯示SAT法檢測疑似淋球菌感染患者尿液標(biāo)本具有較高的靈敏度和特異度，SAT法表現(xiàn)出耗時(shí)短、低污染、結(jié)果準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，而且可以直接用尿液代替生殖器拭子取樣，無侵入感，更為患者所接受，是一種非常值得在臨床上推廣應(yīng)用的檢測方法。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 蘇敬澤，湯全貴.拭子培養(yǎng)、尿沉渣培養(yǎng)和聚合酶鏈反應(yīng)-雜交梳檢測淋球菌[J].中華皮膚科雜志，2001，43（2）：178-180.

[2] Lawe P. Camparison of the gen-probe Aptma CAMBO assay to the AMPLICOR CT/NG assay for detection of chlamydia tra-chamatis and Neissetria gonorrhoeae in urine samples from Aust-talian men and women[J]. J Clin Microbio，2006，44（18）：2619-2621.

[3] 許光輝，趙柳嬋，陳華.實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在肺結(jié)核診斷中的價(jià)值分析[J].臨床肺科雜志，2015，20（8）：1487-1489.

[4] 顧偉鳴，楊陽，吳磊.實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測泌尿生殖道沙眼衣原體感染[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2010， 28（4）：271-272.

[5] Unoki M，Kumamoto K，Takenoshita S，et al. Reviewing the current classification of inhibitor of growth family proteins[J]. Cancer Sci，2009，100（7）：1173-1179.

[6] 李宏，雷質(zhì)文. 食品微生物檢測方法確認(rèn)和證實(shí)手冊[M].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2013：5-90.

[7] 劉勇波，陳燕如.200株淋球菌耐藥檢測結(jié)果分析[J].現(xiàn)代醫(yī)院，2016，16（6）：854-857.

[8] 秦倩倩，朱昊，張麗芬，等.2003年全國行性病流行病學(xué)分析[J].疾病監(jiān)測，2004，19（10）：381-383.

[9] 葉順章.性傳播疾病的實(shí)驗(yàn)室診斷[M].北京：科學(xué)出版社，2001：73-81.

[10] 中國疾病預(yù)防控制中心.2018年4月全國艾滋病性病疫情[J].中國艾滋病性病，2018，24（6）：535.

[11] 彭碧華，黃?；?，梁佩嬋，等.紙片擴(kuò)散法常規(guī)檢測淋球菌藥敏試驗(yàn)可靠性研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2011，18（7）：1353-1355.

[12] 葉順章，王千秋，王荷英，等.PCR檢驗(yàn)技術(shù)在性病臨床標(biāo)本實(shí)驗(yàn)診斷中應(yīng)用價(jià)值的研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志，2002，16（1）：6-8.

[13] 黃培忠，馬超，黃靜.淋病奈瑟菌3種檢測方法結(jié)果分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，6（20）：1750-1751.

[14] 包根書，史大中，陳根.漢防己甲素聯(lián)合阿苯達(dá)唑抑制小鼠棘球蚴生長作用及其機(jī)制的研究[J].地方病通報(bào)，2003，18（4）：20-23.

[15] 張睿，葉阿里，孔令君，等.臨床患者三種性傳播疾病分子生物學(xué)檢測分析[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（3）：107-110.

[16] 張宏萍，包杰.實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和尿液快速檢測法對孕前優(yōu)生健康檢查人群中淋球菌檢測的應(yīng)用比較[J].數(shù)理醫(yī)藥學(xué)雜志，2018，31（6）：907-909.

[17] Peeling RW，Toye B，Jessamine P，et al.Poling of urine speci-mens for PCR testing：acost saving strategy for Chlamydia tracho-matis control programmes[J].Sex Transm Inf，1998，74（1）：66-70.

[18] 徐杰偉，何艷嫦.三種方法檢測淋病奈瑟菌的結(jié)果分析[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011，32（12）：1301-1303.

（收稿日期：2018-09-05）