高效液相色譜法測定0.06%甾烯醇微乳劑中有效成分含量方法研究

曹磊+顧愛國+王莉

摘要 本文采用高效液相色譜法建立了0.06%甾烯醇微乳劑中有效成分含量測定方法，結(jié)果表明，該方法能夠快速準確測定該樣品中有效成分甾烯醇含量，符合對其進行質(zhì)量控制的要求。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；0.06%甾烯醇微乳劑；含量測定

中圖分類號 S481+.8 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）02-0125-02

Determination of Active Component Content in 0.06% β-sitosterol ME by HPLC

CAO Lei GU Ai-guo WANG Li

（Jiangsu Product Quality Testing & Inspection Institute，Nanjing Jiangsu 210007）

Abstract Content determination method of active comonpent in 0.06% β-sitosterol ME by HPLC was evaluated.The results showed that the method could determine the content quickly and accurately.This study could provide scientific basis for the laboratory quality management and control.

Key words HPLC；0.06% β-sitosterol ME；content determination

甾烯醇，化學名稱為2，4 R-乙基膽甾-5烯-3β-醇，具有殺菌活性功能，不溶于水，常溫下微溶于丙酮和乙醇，可溶于苯、氯仿、乙酸乙酯、二硫化碳等有機溶劑，0.06%甾烯醇微乳劑為由甾烯醇原藥、水和適宜助劑制成的半透明均相液體[1-3]。目前僅查得采用薄層掃描法測得其含量[4]，暫無相關(guān)文獻報道采用高效液相色譜法對其質(zhì)量分析方面的研究，本文旨在建立高效液相色譜法（HPLC）測定該產(chǎn)品中有效成分甾烯醇含量的方法，便于進行快速準確的定性及定量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器設(shè)備。Agilent 1260高效液相色譜儀（由美國安捷倫公司生產(chǎn)）；250.0 mm×4.6 mm（i.d）不銹鋼柱，內(nèi)裝ODS-C18，粒徑5 μm的填料；電子分析天平（XS105DU型，METTLER TOLEDO）；超聲清洗儀（KQ-300E，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.1.2 供試藥劑。甲醇（含量99.9%，色譜純，德國Merck）；新蒸二次蒸餾水（18.2MΩ·cm，Milli-Q）；甾烯醇標樣（純度98.5%，企業(yè)提供）；0.06%甾烯醇微乳劑（企業(yè)提供）。

1.2 色譜條件

流動相為甲醇∶水=98∶2（v/v）；流速1.2 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長205 nm；進樣體積 10 μL。

1.3 試驗方法

1.3.1 標樣溶液的配制。精密稱取0.02 g甾烯醇標樣（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，加甲醇后進行超聲溶解，冷卻至室溫后再用甲醇稀釋至刻度，搖勻并過濾即得標樣溶液。

1.3.2 樣品溶液的配制。準確稱取含甾烯醇的試樣0.02 g（精確至0.000 1 g），置于100 mL容量瓶中，加甲醇后進行超聲溶解，冷卻至室溫后用甲醇稀釋至刻度，搖勻并過濾即得樣品溶液。

1.3.3 測定。在上述操作條件下，待儀器穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標樣溶液，直至相鄰2針有效成分峰面積相對變化小于1.5%后，按標樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標樣溶液的順序進行測定。

甾烯醇的質(zhì)量分數(shù)ω（%）按下式計算：

式中：A2—試樣溶液中甾烯醇峰面積的平均值；A1—標樣溶液中甾烯醇峰面積的平均值；m1—標樣的質(zhì)量（g）；m2—試樣的質(zhì)量（g）；w—甾烯醇標樣的質(zhì)量分數(shù)（%）。

1.4 方法學驗證

1.4.1 檢出限及定量限。按照1.3.1所述，配置成0.2 mg/mL的標樣溶液進行測定，按3倍信噪比和10倍信噪比分別計算檢出限和定量限[5-6]。

1.4.2 線性關(guān)系。分別精密稱取甾烯醇標樣0.05 g（精確至0.000 1 g）置于50 mL容量瓶中，加入甲醇后超聲溶解并稀釋得到刻度即得濃度為1.0 mg/mL的工作標準溶液，再分別稀釋得到濃度為0.05、0.10、0.20、0.50 mg/mL的工作標準溶液，將上述5個不同濃度點的供試液的濃度（mg/mL）作為橫坐標，進樣后相應(yīng)的峰面積為縱坐標做工作曲線，擬合回歸線性方程[5-6]。

1.4.3 精密度。將1.3.1所述配置的標樣溶液連續(xù)進樣5次，計算平均峰面積及相對標準偏差（RSD）[5-6]。

1.4.4 回收率。在空白樣品中分別添加0.05、0.20、1.00 mg/mL 3個不同濃度水平的標樣溶液，按照上述試驗步驟進行加標回收率測定，每個添加水平各配置3份供試品溶液（n=9），計算平均回收率及相對標準偏差（RSD）[5-6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

參考甾烯醇的溶解性特點得出其極性偏弱，并結(jié)合研究采用的色譜體系為反相體系，故考察了不同混合比例的甲醇-水及乙腈-水作為流動相。

經(jīng)過摸索優(yōu)化，得出當流動相為甲醇與水混合比例為98∶2，且流速為1.2 mL/min時，能較好地實現(xiàn)樣品中各組分的有效分離，排除了與甾烯醇相鄰峰的干擾，且峰型良好，可作為理想條件。endprint

2.2 檢出限及定量限

將標樣溶液經(jīng)過多步稀釋后逐一濃度進樣，最終得出甾烯醇的檢出限為1.79 μg/mL，定量限為5.96 μg/mL。

2.3 線性關(guān)系

由圖1可知，甾烯醇的線性方程Y=369.62X+700.99（n=5），相關(guān)系數(shù)為0.999 4，線性范圍為50～1 000 μg/mL。

2.4 精密度

精密度驗證結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明該方法精密度良好，滿足檢測要求。

2.5 回收率

該檢測方法加標回收率試驗結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明，在添加設(shè)計的低、中、高3個濃度標準溶液后，回收率及相對標準偏差均符合檢測要求。

2.6 樣品測定

選取企業(yè)提供0.06%甾烯醇微乳劑作為供試樣品，按照本文所述試驗方法對其有效成分進行檢測，標樣及樣品的液相圖譜如圖2、3所示。結(jié)果表明，該檢測方法具有操作簡便及快速準確的特點。

3 結(jié)論

本文通過試驗研究建立了0.06%甾烯醇微乳劑含量的高效液相色譜檢測方法，并據(jù)此對樣品進行了檢測。結(jié)果表明，該方法完全適用于該產(chǎn)品有效成分的含量測定，對于嚴格控制該產(chǎn)品質(zhì)量具有積極意義。

4 參考文獻

[1] 劉煥梅，李立軍，孫曉然，等.孕甾烯醇酮吡咯化合物的制備[J].精細石油化工，2013，30（3）：32-34.

[2] 申向榮，張德志.枳椇子石油醚部位的化學成分研究[J].廣東藥學院學報，2006（6）：594-595.

[3] 韓富根，盧葉，姬小明，等.新型吡咯類衍生物的合成[J].有機化學，2010（7）：1080-1083.

[4] 陸蘊如，楊曉云，沙德智.五種黨參中△～7-豆甾烯醇、果糖的含量測定[J].中國中藥雜志，1989（8）：36-38.

[5] 國家藥典委員會.《中華人民共和國藥典》2015版二部附錄[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2016.

[6] 農(nóng)藥產(chǎn)品質(zhì)量分析方法確認指南：NY/T 2887-2016[S/OL].[2017-09-20].http：//www.safehoo.com/Standard/Trade/Chemical/201705/483465.shtml.endprint