HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124個(gè)體識(shí)別試劑盒在降解檢材中的應(yīng)用

（岳陽(yáng)市公安局刑偵支隊(duì) 刑事科學(xué)技術(shù)研究所，湖南 岳陽(yáng) 414000）

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為第三代遺傳標(biāo)記，在人類基因組中分布廣泛，突變率低，廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、藥物學(xué)、人類進(jìn)化及法醫(yī)學(xué)等研究[1]。相對(duì)于STR基因座的高突變率及片段檢測(cè)要求，學(xué)者預(yù)測(cè)在未來(lái)SNP將替代STR基因座成為法醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用的主要遺傳標(biāo)記[1]。目前，法醫(yī)學(xué)常用的SNP檢測(cè)技術(shù)如SNPlex、SNapShot、Massarray等，最多只能對(duì)幾十個(gè)SNP位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)[1-3]，從而限制了SNP位點(diǎn)的廣泛使用。本研究中，HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124個(gè)體識(shí)別試劑盒作為基于二代測(cè)序Ion Torrent PGM平臺(tái)開(kāi)發(fā)的第一個(gè)商業(yè)化SNP檢測(cè)試劑盒，包含90個(gè)已驗(yàn)證的全球通用常染色體SNP位點(diǎn)和34個(gè)Y染色體系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上最大單倍型SNP位點(diǎn)。目前，該試劑盒在中國(guó)人群中的數(shù)據(jù)驗(yàn)證已完成，結(jié)果顯示該試劑盒中所含有的大部分SNP位點(diǎn)多態(tài)性豐富[4]。本研究嘗試采用該試劑盒對(duì)日常檢案工作中無(wú)法獲取完整DNA分型的降解檢材進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

20例降解檢材均來(lái)自于岳陽(yáng)市公安局刑偵支隊(duì)刑事科學(xué)技術(shù)研究所，采用QIAamp血液樣本抽提試劑盒（德國(guó)Qiagen公司）提取DNA，用QuantifilerTMHuman DNA定量試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行DNA定量。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品采用9948。

毛細(xì)管電泳檢測(cè)：對(duì)提取的DNA采用HuaxiaTMPlatinum PCR擴(kuò)增試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行23個(gè)常染色體STR基因座的檢測(cè)，具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。PCR產(chǎn)物在3500xL基因分析儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行基因分型檢測(cè)。檢測(cè)成功基因座要求等位基因相對(duì)熒光單位（relative fluorescein unit，RFU）大于50，若為雜合子，其均衡性大于60%[4]。

二代測(cè)序檢測(cè)：采用HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124個(gè)體識(shí)別試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）對(duì)上述20份檢材進(jìn)行檢測(cè)分析。具體操作為DNA文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)定量、乳液PCR反應(yīng)、文庫(kù)富集、測(cè)序及結(jié)果分析。其中，DNA文庫(kù)構(gòu)建采用Ampliseq技術(shù)及相應(yīng)的Ion AmpliSeqTM2.0-96LV文庫(kù)制備試劑盒（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），最終文庫(kù)構(gòu)建 PCR 體系為 20 μL，含 4 μL 5× Ion AmpliSeq HiFi反應(yīng)混合 液，10 μL 2× HID-Ion AmpliSeqTMIdentity Panel SNP-124引物混合物，DNA含量為10 ng以內(nèi)，其余體積用去離子水補(bǔ)齊。文庫(kù)構(gòu)建的PCR條件：99℃ 2 min；99℃ 15 s，60℃ 4 min，23個(gè)循環(huán)；產(chǎn)物10℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2μL FuPa對(duì)引物進(jìn)行部分消化，并進(jìn)行磷酸化。處理?xiàng)l件：50℃10min，55℃ 10min，60℃ 20min，10℃保存，保存時(shí)間不宜超過(guò)1h。之后，加入2μL已提前稀釋的Barcode、4 μL Switch Solution以及2 μL DNA連接酶，總反應(yīng)體積為30μL。處理?xiàng)l件：22℃ 30min，72℃ 10min，10℃保存。產(chǎn)物在1h內(nèi)進(jìn)行純化處理或者于-20℃冷凍保存，采用實(shí)時(shí)定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）對(duì)文庫(kù)進(jìn)行精確定量。乳液PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表1。

按照表1將PCR體系準(zhǔn)備好后，再加入100μL充分振蕩混勻的Ion PGMTMTemplate OT2 200 Ion SphereTMParticles（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），15 min內(nèi)在Ion OneTouchTM2乳液PCR儀上選擇“Ion PGMTMTemplate OT2 200 Kit”選項(xiàng)進(jìn)行乳液PCR，時(shí)間約8 h。產(chǎn)物取出時(shí)間不超過(guò)16 h（從反應(yīng)開(kāi)始計(jì)時(shí)）。之后在Ion OneTouchTMES儀器（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上進(jìn)行ISP磁珠富集。富集后的文庫(kù)在Ion Torrent PGM儀器（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）上采用“Ion PGMTMSequencing 200 v2”程序進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。Flow數(shù)為500。采用HID_SNP_Genotyper.42（v4.2）（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。檢測(cè)成功位點(diǎn)要求測(cè)序reads數(shù)大于100，雜合子均衡性大于60%[4]。

表1 乳液PCR體系配置

2 結(jié)果與討論

陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品9948采用常規(guī)毛細(xì)管電泳檢測(cè)和二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)均可以獲得完整的分型結(jié)果。其中，9948在23個(gè)STR基因座的分型結(jié)果與試劑盒說(shuō)明書(shū)中所提供的一致，9948在124個(gè)SNP位點(diǎn)的分型結(jié)果與文獻(xiàn)[4]中提供的結(jié)果一致，表明上述方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性可滿足實(shí)際工作需要。

20例降解樣本的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。其中，采用毛細(xì)管電泳檢測(cè)均不能獲得完整的分型結(jié)果，檢測(cè)成功的基因座數(shù)目為5～20個(gè)，即基因座檢測(cè)成功率為21.7%～87.0%，平均檢測(cè)成功率為45.8%。對(duì)于雜合子分型，采用等位基因峰值較低與等位基因峰值較高的峰高比值進(jìn)行均衡性評(píng)估，單個(gè)樣本的雜合子均衡性范圍分布為60.8%～75.6%，20個(gè)樣本的平均雜合子均衡性為66.1%。對(duì)于上述20份樣本采用二代測(cè)序的結(jié)果表明：7份樣本可以獲取完整分型，即在124個(gè)SNP位點(diǎn)上均有測(cè)序信號(hào)峰，且reads數(shù)大于100；對(duì)于檢測(cè)到兩個(gè)等位基因信號(hào)值的分型，采用測(cè)序信號(hào)低的等位基因reads數(shù)與測(cè)序信號(hào)高的reads數(shù)的比值進(jìn)行均衡性評(píng)估，均高于60%。最低的測(cè)序成功率為1號(hào)樣本（42.0%），雜合子均衡性為78.6%，檢測(cè)到的測(cè)序數(shù)據(jù)均真實(shí)可信。20份樣本的平均檢測(cè)成功率為82.7%，平均雜合子均衡性為74.8%，相較于毛細(xì)管電泳差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 20例降解樣本采用毛細(xì)管電泳和二代測(cè)序檢測(cè)的結(jié)果

研究結(jié)果表明，當(dāng)DNA發(fā)生降解時(shí)，采用常規(guī)毛細(xì)管電泳進(jìn)行檢測(cè)，常發(fā)生基因座檢測(cè)不完全的現(xiàn)象，主要原因在于：毛細(xì)管電泳檢測(cè)主要依靠對(duì)片段的大小進(jìn)行判別分析，在體系設(shè)計(jì)時(shí)需根據(jù)可選熒光素?cái)?shù)量及片段的大小差異進(jìn)行排列分布。當(dāng)DNA發(fā)生降解時(shí)，大片段常常無(wú)法獲取有效擴(kuò)增片段。本研究中HID-Ion AmpliSeqTMSNP-124個(gè)體識(shí)別試劑盒中含有的SNP位點(diǎn)對(duì)于片段的大小無(wú)要求，可以將其設(shè)計(jì)得盡量短，其中常染色體SNP位點(diǎn)的平均文庫(kù)大小為132 bp，Y-SNP位點(diǎn)的平均文庫(kù)大小為141 bp，對(duì)其中7個(gè)降解檢材可獲取完整分型。上述結(jié)果均提示，采用二代測(cè)序及SNP位點(diǎn)對(duì)于降解檢材可以獲取更為豐富的遺傳信息，用于法醫(yī)學(xué)身份識(shí)別。