微量生物檢材定量及分型

宋 立，劉 松，吳 卉，方少平，傅燕芳

（1.杭州市公安局西湖區(qū)分局刑事科學技術(shù)室，浙江 杭州 310013；2.浙江省公安物證鑒定中心 浙江省刑事科學技術(shù)應(yīng)用研究重點實驗室，浙江 杭州 310009）

在過去的十年間，法庭科學領(lǐng)域?qū)崟r熒光定量PCR技術(shù)成為了備受追捧的DNA定量技術(shù)，靈敏度高、結(jié)果客觀、自動化程度高，且具有人源樣本特異性[1]。通過多重PCR方法可以檢測總?cè)嗽碊NA、男性DNA或者線粒體DNA[2-3]。商品化的定量試劑盒旨在測定樣品的濃度值以及降解程度，從而指導PCR反應(yīng)中DNA的總量，提高下游分型的成功率[4-5]。在進行STR分型時，一般要求樣品質(zhì)量濃度在1.0 ng/μL或在0.5～1.5ng/μL以獲得較優(yōu)的分型結(jié)果[6]。對于目前日常刑事案件中的微量生物檢材而言，這個質(zhì)量濃度范圍過于苛刻，微量檢材樣品質(zhì)量濃度往往低于0.5ng/μL。本研究針對微量生物檢材，構(gòu)建可獲得有效STR分型結(jié)果的定量閾值模型，以期在日常檢案工作中使用該定量閾值模型對微量生物檢材的檢測進行指導，靈活調(diào)整常規(guī)PCR擴增方案，提高刑事技術(shù)DNA檢驗的科學性和有效性。

1 材料與方法

1.1 樣品

采集903個單一個體微量檢材，均采用棉簽拭子兩步法[7]進行擦拭采集。DNA標準品9947A購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 主要試劑及儀器

QIAamp?DNA Investigator試劑盒（以下簡稱QIAamp試劑盒，德國Qiagen公司），Investigator Quantiplex試劑盒（德國Qiagen公司），AmpF?STRTMIdentifilerTMPlus PCR擴增試劑盒（以下簡稱ID plus試劑盒，美國Thermo Fisher Scientific公司）。

QIAcube全自動核酸純化儀、Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀（德國Qiagen公司），Veriti PCR儀、3500xL基因分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 實驗方法

標準品處理：對DNA標準品9947A進行7次梯度稀釋，稀釋比例分別為4倍、7倍、10倍、13倍、20倍、30倍、40倍。

樣本DNA提取：對903個現(xiàn)場采集的微量檢材采用QIAcube全自動核酸純化儀進行提取，使用配套QIAamp試劑盒進行DNA抽提和純化，操作流程為儀器內(nèi)置標準程序，洗脫體積為60μL。

定量：根據(jù)Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀操作說明，使用Investigator Quantiplex試劑盒對樣品進行定量檢測，每個樣品重復3次。該定量試劑盒自帶一套內(nèi)部擴增對照參數(shù)（內(nèi)參），可用于檢測DNA擴增效果并檢測PCR抑制劑。

擴增及分型：采用ID plus試劑盒對上述樣品進行PCR擴增檢測。PCR擴增體系為25μL，其中反應(yīng)混合物10μL、引物混合物5μL、模板DNA 10μL。采用兩種PCR反應(yīng)條件（28個PCR循環(huán)和30個PCR循環(huán)）進行擴增，PCR擴增條件參見說明書。PCR產(chǎn)物在3500xL基因分析儀上進行毛細管電泳，采用Gene-MapperTMID-X軟件進行STR基因座分型。

2 結(jié)果與討論

本研究主要使用Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀，配以Investigator Quantiplex試劑盒進行定量研究，其中標準曲線的準確生成至關(guān)重要，是能否成功定量的關(guān)鍵。標準曲線由Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀自帶軟件生成，生成依據(jù)主要是標準品的拷貝數(shù)及其循環(huán)閾值（Ct值），采用決定系數(shù)（R2）反映標準曲線的質(zhì)量。使用5個以上的數(shù)據(jù)制作標準曲線，保證決定系數(shù)（R2）大于0.99，斜率在0.8～1為定量分析的金標準[8-9]。本實驗采用9947A及其7個稀釋樣品進行定量，進行3次重復，繪制標準曲線。標準曲線的平均決定系數(shù)（R2）為0.99558，斜率為0.81，表明該標準曲線模型具有較優(yōu)線性關(guān)系且定量具有可信度。DNA標準品9947A的STR擴增結(jié)果見表1。當DNA標準品9947A采用10倍稀釋，即DNA質(zhì)量濃度為0.0200ng/μL時，采用28個循環(huán)，出現(xiàn)等位基因丟失現(xiàn)象，嘗試增加2個循環(huán)數(shù)（30個PCR循環(huán)）進行PCR反應(yīng)，可獲取完整DNA分型結(jié)果。當進行更高倍數(shù)稀釋時（13～40倍），增加循環(huán)數(shù)可有效提高STR基因座的檢出率。

同時對903個微量生物檢材DNA模板使用相同方法進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)內(nèi)參擴增正常，無明顯抑制成分，質(zhì)量濃度范圍在0.002 3～0.450 1 ng/μL。根據(jù)標準品定量濃度的閾值模型，將待測樣品根據(jù)質(zhì)量濃度劃分為4個區(qū)間進行后續(xù)檢驗，結(jié)果見表2。

表1 定量濃度閾值模型

表2 樣品DNA獲得有效分型的檢出率

樣品質(zhì)量濃度＞0.03 ng/μL的共251個，使用ID plus試劑盒推薦的28個循環(huán)擴增方案，235個樣品可以獲得完整的15個STR分型結(jié)果，基因座檢出率為14.25%；樣品質(zhì)量濃度＞0.02～0.03ng/μL的共227個，28個循環(huán)擴增方案，平均檢出基因座個數(shù)為7.12個，通過增加PCR熱循環(huán)參數(shù)至30個循環(huán)，獲得較完整的分型結(jié)果，基因座檢出率為13.72%；樣品質(zhì)量濃度＞0.01～0.02ng/μL的共160個，28個循環(huán)擴增方案，平均檢出基因座個數(shù)為4.25個，采用30個PCR熱循環(huán)，基因座檢出率為7.25%；樣品質(zhì)量濃度≤0.01ng/μL的共265個，采用28個循環(huán)，擴增均失敗，無有效基因座分型，即便通過增加PCR熱循環(huán)參數(shù)至30個循環(huán)，得到有效等位基因個數(shù)仍極少，基因座檢出率為2.80%，視為無效檢出結(jié)果。903個微量生物樣品的檢出情況與標準品檢出基因座情況吻合，故通過903個日常微量檢材驗證了該模型的有效性。該結(jié)果與THOMAS等[1]報道的質(zhì)量濃度小于0.008 9 ng/μL時，平均每個樣品可提供6個完整基因座分型的結(jié)果有所差異，可能是由于該研究樣本量僅為9個。

另外，265份檢材質(zhì)量濃度≤0.01 ng/μL的樣品，經(jīng)后續(xù)擴增檢測所得均為無效結(jié)果，占比29.35%，浪費大量的人力物力?；诒緦嶒炈鶚?gòu)建的定量閾值模型，認為對微量檢材應(yīng)根據(jù)熒光定量值指導后續(xù)的擴增檢測工作和優(yōu)化擴增方案從而提高檢驗成功率。