大鼠視神經(jīng)挫傷致視網(wǎng)膜硫化氫合成酶表達變化

曾銘偉，王 濤 ，費成平，鄒彩霞，劉夷嫦，谷振勇

（1.南通大學醫(yī)學院法醫(yī)學系，江蘇 南通 226001；2.南通大學附屬醫(yī)院司法鑒定所，江蘇 南通 226001）

在法醫(yī)學鑒定實踐中，視神經(jīng)外傷引起的視力降低、視野缺損等視功能障礙極為常見。視神經(jīng)損傷引起的繼發(fā)性視網(wǎng)膜損害、視信號整合異常是視功能降低的重要發(fā)生機制。視神經(jīng)損傷引起視網(wǎng)膜損害的分子機制至今尚未完全明確。硫化氫是一種內(nèi)源性氣體信使分子，具有調(diào)節(jié)N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體活性、長時程增強和血壓等生理功能，并在缺血再灌注損傷、炎癥反應和神經(jīng)退行性疾病等諸多病理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[1]。已有實驗[2-4]證明，哺乳類動物眼球存在著內(nèi)源性硫化氫生成。硫化氫生成的限速酶主要有胱硫醚γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase，CSE）、胱硫醚β-合成酶（cystathionine β-synthase，CBS）和3-巰基丙酮酸硫基轉(zhuǎn)移酶（3-mercaptopyruvate sulfurtransferase，3-MST）[1]。本研究通過復制大鼠視神經(jīng)挫傷模型，用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測視神經(jīng)挫傷過程中視網(wǎng)膜CBS、CSE和3-MST的表達變化，為進一步研究內(nèi)源性硫化氫在外傷性視神經(jīng)損傷致視網(wǎng)膜繼發(fā)性損害中的作用奠定實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

CBS、CSE和3-MST抗體購自美國Santa Cruz公司；放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（強）、焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，DEPC）水、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、Tris、Glycine等均購自上海碧云天生物技術(shù)公司；TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；EzOmicsTMOne-Step qPCR試劑盒購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

全自動酶標儀、核酸蛋白定量檢測儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），臺式離心機（美國Beckman Coulter公司），實時熒光定量PCR儀（德國Eppendorf公司），基礎(chǔ)型穩(wěn)壓電泳儀、Mini-PROTEAN 4型垂直電泳槽和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），EVOS熒光顯微鏡（美國Life Technologies公司），Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 實驗動物

SD大鼠，SPF級，雌雄不限，體質(zhì)量為180～200g，共53只，由南通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。給予大鼠清潔飲食，在光/暗周期為12 h/12 h、溫度為25℃條件下喂養(yǎng)。實驗操作符合《南通大學實驗動物管理條例》的相關(guān)規(guī)定。實驗前對大鼠進行檢查，確保雙眼無眼疾，瞳孔等大等圓，對光反射靈敏，眼底無異常。

1.3 視神經(jīng)挫傷大鼠模型建立及實驗分組

本研究設(shè)置正常對照組、視神經(jīng)挫傷組和假手術(shù)組，均以左眼為實驗眼。

視神經(jīng)挫傷組：大鼠以10%水合氯醛溶液腹腔注射（0.4 mL/100 g）麻醉，手術(shù)區(qū)及周圍用碘附消毒。沿大鼠頭頂正中做矢狀切口，鈍性分離眶周組織找到視神經(jīng)，用彎頭鑷將視神經(jīng)與中央動靜脈分開，充分暴露視神經(jīng)。用交叉自閉彈力動脈夾在球后2mm處垂直于視神經(jīng)軸夾閉視神經(jīng)15 s。此時可觀察到大鼠傷眼瞳孔立即散大，初步判斷建模成功。消毒縫合切口并用氧氟沙星藥膏涂抹傷眼，待大鼠麻醉蘇醒后回籠飼養(yǎng)。術(shù)后1d觀察眼球無明顯突出或干癟，檢眼鏡觀察眼底無明顯出血者為成功模型[5]。

假手術(shù)組：大鼠除了不給予夾閉視神經(jīng)外，其他處理均與視神經(jīng)挫傷大鼠完全相同。

正常對照組：大鼠不進行任何處理。

觀察視網(wǎng)膜組織病理學變化及檢測視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量、視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度的實驗，分為正常對照組，視神經(jīng)挫傷后3 d、7 d和14 d組以及假手術(shù)組，每組5只大鼠，共25只。

檢測CBS、CSE和3-MST基因表達的實驗，分為正常對照組，視神經(jīng)挫傷后3d、7d和14d組，假手術(shù)后3d、7d和14d組，每組4只大鼠，共28只。因大鼠肝組織存在CBS、CSE和3-MST基因表達[6]，本部分實驗同步檢測肝組織CBS、CSE和3-MST基因表達作為陽性對照，以驗證本檢測方法的適用性。

1.4 視網(wǎng)膜組織病理學檢驗

視神經(jīng)挫傷后3d、7d和14d，麻醉大鼠滿意后迅速打開胸腔、暴露心臟，將灌注針頭從心尖經(jīng)左心室插入主動脈，剪開右心耳。先用生理鹽水灌注直至右心耳流出清亮液體，換用4%多聚甲醛溶液灌注固定處理。于眼球12點鐘位近角膜緣處縫線標記，迅速摘出眼球，保留球后約4～5 mm長視神經(jīng)，浸入4%多聚甲醛固定液固定24h。剪去角膜，常規(guī)制作石蠟切片，HE染色，于顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.5 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)及視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度檢測

每組取5張切片，每張切片隨機取5個視野，分別計算視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量。

在距離視盤約400 μm處用EVOS熒光顯微鏡測微尺直接測量鼻側(cè)視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分即神經(jīng)纖維層至內(nèi)核層的厚度，每組取4張切片，單位為μm。

1.6 實時熒光定量PCR檢測CBS、CSE和3-MST的mRNA表達

RNA提?。涸诟鲿r間點將大鼠麻醉滿意后，迅速提取大鼠視網(wǎng)膜，置入預冷的勻漿器，加入TRIzol試劑（2 mL/100 mg），冷凍勻漿，按照TRIzol試劑盒說明書提取RNA。加0.5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）溶解RNA，定量檢測其純度和濃度，提取出的RNA進行PCR。

引物設(shè)計：用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。應用美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的 Primer-BLAST 進行引物特異性驗證，CBS、CSE、3-MST和內(nèi)參GADPH基因的引物序列見表1。

表1 CBS、CSE、3-MST和GADPH基因的引物序列

實時熒光定量PCR（SYBR GreenⅠ染料）反應體系為：RNA模板1 μL，上游引物（5 μmol/L） 1 μL，下游引物（5 μmol/L） 1 μL，2×SYBR One-Step qPCR Mix 12.5 μL，最后加 DEPC 水至 25 μL。反應條件：42℃ 30 min；95℃ 10 min，95℃ 20 s；60℃ 30 s，72℃ 30s，95℃ 15s。

PCR結(jié)果分析：導出實時熒光定量PCR的Ct值，ΔΔCt值=樣品目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，計算目的基因相對于內(nèi)參基因的表達比，即2-ΔΔCt。

目的基因相對表達量：將對照組CBS、CSE和3-MST的mRNA表達量設(shè)定為1.0，換算各實驗組目的基因的mRNA相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學處理

實驗數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜組織病理學改變

正常對照組大鼠視網(wǎng)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞呈單層分布、排列整齊，胞核呈圓形或橢圓形，核仁明顯。與正常對照組相比，假手術(shù)組組織結(jié)構(gòu)無明顯差異。視神經(jīng)挫傷后3d組視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層水腫，呈蜂窩狀，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量略減少；視神經(jīng)挫傷后7d組視網(wǎng)膜水腫減輕，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯減少且潰變壞死；視神經(jīng)挫傷后14d組視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分特別是神經(jīng)纖維層和內(nèi)叢層厚度明顯變薄、基質(zhì)疏松，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量明顯減少。詳見圖1，表2。

2.2 視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量變化

與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，視神經(jīng)挫傷后各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量呈時間依賴性減少，視神經(jīng)挫傷后3d、7d和14d組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量分別降低了7.29%、30.60%（P＜0.05）和40.94%（P＜0.05）。詳見表2。

圖1 各組視網(wǎng)膜的組織病理學改變（HE×400）

表2 大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量和視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度變化 （±s）

表2 大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量和視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度變化 （±s）

注：1）與假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與相鄰上組比較，P＜0.05

視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度（n=4，μm）102.59±3.42 102.76±4.72 98.58±4.77 91.26±3.751）2）80.32±3.501）2）組別正常對照假手術(shù)視神經(jīng)挫傷后3d視神經(jīng)挫傷后7d視神經(jīng)挫傷后14d視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量（n=5，個）37.86±2.14 37.32±2.22 34.60±3.33 25.90±2.891）2）22.04±1.931）2）

2.3 視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度變化

與正常對照組比較，假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，視神經(jīng)挫傷后各組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度呈時間依賴性變薄，視神經(jīng)挫傷后3d、7d和14d組視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度分別變薄了4.07%、11.19%（P＜0.05）和21.84%（P＜0.05），詳見表2。

2.4 視網(wǎng)膜CBS、CSE和3-MST的mRNA表達變化

從陽性對照肝組織中檢測出大量CBS、CSE和3-MST的mRNA基礎(chǔ)表達，同步檢測結(jié)果顯示，正常對照組大鼠視網(wǎng)膜同時存在著CBS、CSE和3-MST的mRNA表達。與正常對照組比較，假手術(shù)3 d、7 d和14d組CBS、CSE和3-MST mRNA表達變化差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與相同時間點假手術(shù)組比較，視神經(jīng)挫傷后3 d、7 d和14 d組大鼠視網(wǎng)膜CBS和3-MST mRNA表達呈時間依賴性明顯上調(diào)，CBS mRNA分別增加了 42.20%（P＜0.05）、74.77%（P＜0.05）和147.83%（P＜0.05），3-MST mRNA分別增加了5.94%（P＞0.05）、11.01%（P＞0.05）和 39.583%（P＜0.05）。而CSE mRNA表達呈先增高后降低變化，視神經(jīng)挫傷后3 d、7 d組CSE mRNA表達明顯上調(diào)，分別增加了168.93%（P＜0.05）、487.13%（P＜0.05），14 d 時 CSE mRNA表達較7 d時呈降低趨勢，但與假手術(shù)組比較仍增加了166.35%（P＜0.05）。詳見表3。

表3 視神經(jīng)挫傷3d、7d和14d時大鼠視網(wǎng)膜CBS、CSE和3-MST mRNA表達變化 （n=4，±s）

表3 視神經(jīng)挫傷3d、7d和14d時大鼠視網(wǎng)膜CBS、CSE和3-MST mRNA表達變化 （n=4，±s）

注：1）與相同時間點假手術(shù)組比較，P＜0.05；2）與視神經(jīng)挫傷后3d組比較，P＜0.05；3）與視神經(jīng)挫傷后7d組比較，P＜0.05

組別陽性對照肝組織正常對照假手術(shù)后3d假手術(shù)后7d假手術(shù)后14d視神經(jīng)挫傷后3d視神經(jīng)挫傷后7d視神經(jīng)挫傷后14d 13.19±5.63 1.00±0.00 1.09±0.14 1.07±0.21 0.92±0.21 1.55±0.261）1.87±0.161）2.28±0.361）2）252.22±27.53 1.00±0.00 1.03±0.15 1.01±0.41 1.04±0.27 2.77±1.281）5.93±2.371）2.77±1.001）3）8.44±2.03 1.00±0.00 1.01±0.08 1.09±0.37 0.96±0.13 1.07±0.14 1.21±0.18 1.34±0.141）2）CBS CSE 3-MST

3 討 論

頭部、顏面部尤其是眼部受到鈍性暴力作用時，由于生物力傳導，可單獨引起視神經(jīng)損傷，有時顱腦外傷會并發(fā)視神經(jīng)損傷。當視神經(jīng)損傷嚴重時，其與視功能降低之間的因果關(guān)系明確，法醫(yī)學鑒定難度不大。但也存在原發(fā)性視神經(jīng)損傷輕微，于受傷當時僅有一過性視力模糊等輕度視功能障礙，或經(jīng)過激素沖擊治療視力得以迅速恢復，而傷后10～20d出現(xiàn)進行性視力下降乃至失明的情況。鑒于視力明顯降低與外傷之間存在一定的時間延遲，在某些特定情況下，鑒定外傷與視力降低之間的因果關(guān)系難度極大，這類案件往往成為纏訴案件?；谝暽窠?jīng)外傷后視功能障礙一方面是因為視神經(jīng)傳遞視信號受阻，另一方面是視神經(jīng)損傷引起的視網(wǎng)膜繼發(fā)性損害，進而導致視信號在視網(wǎng)膜整合、加工處理時異常。因此，研究視神經(jīng)外傷引起的視網(wǎng)膜繼發(fā)性損害的分子機制，有助于從分子水平揭示外傷與視力降低之間的因果關(guān)系，為相關(guān)案件的法醫(yī)學鑒定提供實驗基礎(chǔ)。本研究從外傷性視神經(jīng)損傷導致視功能障礙的發(fā)生機制入手，用交叉自閉彈力動脈夾在球后2mm處垂直于視神經(jīng)軸夾閉視神經(jīng)15 s，建立大鼠視神經(jīng)挫傷模型。結(jié)果顯示，視神經(jīng)挫傷引起了大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量減少和視網(wǎng)膜內(nèi)側(cè)部分厚度明顯變薄，并且呈一定的時間依賴性變化，同時得到了視網(wǎng)膜組織病理學確證，這與以往研究[7-8]報道基本一致，表明本實驗結(jié)果確切、可信。

內(nèi)源性硫化氫是機體含硫氨基酸轉(zhuǎn)硫代謝過程中的代謝產(chǎn)物之一，是繼一氧化氮、一氧化碳之后的第3種氣體信號分子，具有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能[1]。內(nèi)源性硫化氫生成異?？赡芙閷Я烁哐獕翰9]、創(chuàng)傷誘導的急性肝損傷[10]等諸多病理過程。研究內(nèi)源性硫化氫的生成變化、調(diào)控及其生物學效應，特別是硫化氫在病理過程中的作用已成為生物醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點。內(nèi)源性硫化氫的生成并有可能存在生物學效應首先發(fā)現(xiàn)于腦組織。已有研究結(jié)果[1]表明，硫化氫生成的限速酶具有組織分布特性，CBS主要分布于腦、外周神經(jīng)、肝、腎和胰島，CSE主要分布于心血管、平滑肌和肝等。3-MST發(fā)現(xiàn)較晚，其組織分布尚不清楚。KULKARNI等[3]發(fā)現(xiàn)牛眼視網(wǎng)膜可表達CSE和CBS，CBS激活劑可上調(diào)牛眼的內(nèi)源性硫化氫水平。MIKAMI等[4]發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜組織有3-MST的表達。PONG等[11]發(fā)現(xiàn)蠑螈等兩棲類動物視網(wǎng)膜存在CSE和CBS表達，而小鼠視網(wǎng)膜僅有微弱的CSE和CBS活性。既往研究提示哺乳類動物眼組織有內(nèi)源性硫化氫生成，對眼球功能可能有調(diào)節(jié)作用。然而，在大鼠視網(wǎng)膜上硫化氫生成酶的表達變化迄今為止文獻報道尚少。為確保實驗結(jié)果真實可信，本實驗選擇公認存在CBS和CSE的肝組織為陽性對照，同時提取大鼠肝組織總RNA以及視網(wǎng)膜總RNA，然后檢測視網(wǎng)膜CBS、CSE和3-MST的mRNA表達。結(jié)果顯示，肝組織有大量CBS、CSE和3-MST mRNA表達，同時，在正常對照組大鼠視網(wǎng)膜檢測到CBS、CSE和3-MST的mRNA表達，其中CBS表達水平最高，3-MST表達水平較高，CSE表達水平相對較低。這與經(jīng)典的硫化氫合成酶組織分布特點[1]一致，為檢測視神經(jīng)挫傷過程中視網(wǎng)膜CBS、CSE、3-MST的mRNA表達變化奠定了扎實的實驗基礎(chǔ)。本研究結(jié)果顯示：在視神經(jīng)挫傷后3d、7d和14d時CBS mRNA表達呈時間依賴性上調(diào)，最高增加了147.83%；在視神經(jīng)挫傷后CSE mRNA表達明顯上調(diào)并于7d時到達峰值，于14d時有所降低但仍明顯高于假手術(shù)組，CSE mRNA表達呈現(xiàn)上調(diào)速度快、幅度更大的特點；在視神經(jīng)挫傷后3d、7d時3-MST mRNA表達呈上調(diào)趨勢而在視神經(jīng)挫傷后14d時明顯上調(diào)。應當指出，與CBS、CSE表達上調(diào)幅度相比，3-MST表達變化范圍明顯較小。本研究從mRNA水平反映視神經(jīng)挫傷后大鼠視網(wǎng)膜3種硫化氫合成酶呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。然而，本研究尚未涉及CBS、CSE和3-MST在視網(wǎng)膜具體的層次或不同類型細胞中的定位表達，這有待進一步研究。視神經(jīng)挫傷后大鼠視網(wǎng)膜CBS、CSE和3-MST表達上調(diào)的生物學效應目前尚不清楚。前期研究發(fā)現(xiàn)，視神經(jīng)挫傷能引起視網(wǎng)膜氧化損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[12]，外源性硫化氫能減輕視神經(jīng)挫傷后繼發(fā)性視網(wǎng)膜損傷[13]，抑制內(nèi)源性硫化氫生成能加劇視神經(jīng)挫傷引起的視網(wǎng)膜損傷[14]，硫化氫通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜Ca2+含量而減輕光誘導的視網(wǎng)膜變性[4]，調(diào)節(jié)眼球前房睫狀體收縮功能[2]，提示視神經(jīng)挫傷后大鼠視網(wǎng)膜CBS、CSE和3-MST表達上調(diào)很可能導致視網(wǎng)膜局部內(nèi)源性硫化氫生成增多，起到減輕繼發(fā)性視網(wǎng)膜損傷的作用，這有待進一步研究予以證實。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，視神經(jīng)挫傷后大鼠視網(wǎng)膜CBS、CSE和3-MST表達上調(diào)，其中，CSE表達上調(diào)幅度大、速度快，CBS表達上調(diào)速度相對較慢但上調(diào)幅度同樣比較大，3-MST表達上調(diào)幅度最小，這些變化可能引起視網(wǎng)膜局部內(nèi)源性硫化氫生成增多并產(chǎn)生代償性保護效應。