人體尿液中卡西酮類毒品的SPE-GC-MS定性定量分析

王 平 ，劉曉云 ，3，劉 遙 ，羅葉鋒 ，王 震

（1.廣州正孚檢測(cè)技術(shù)有限公司，廣東 廣州 510663；2.廣東正孚法醫(yī)毒物司法鑒定所，廣東 廣州510663；3.廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)股份有限公司，廣東 廣州 510663）

卡西酮類毒品是近些年出現(xiàn)的新型毒品，在世界范圍內(nèi)已形成濫用趨勢(shì)，其母體結(jié)構(gòu)為卡西酮，主要包括甲卡西酮（methcathinone，MC）、4-甲基甲卡西酮（4-methyl methcathinone，mephedrone）和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮（3，4-methylenedioxy-N-methylcathinone，methylone）等?？ㄎ魍愇镔|(zhì)濫用會(huì)導(dǎo)致健康問(wèn)題和毒品依賴，過(guò)量濫用易造成不可逆的永久性腦部損傷甚至死亡。目前，《精神藥品品種目錄（2013年版）》已將甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮、3，4-亞甲二氧基甲卡西酮收入管制目錄。近年來(lái)，卡西酮類毒品已在我國(guó)沿海地區(qū)及陜西、山西等地泛濫[1]，大劑量乙醇與甲卡西酮共同作用甚至可引起死亡的發(fā)生[2]。因此有必要建立方便、快捷、準(zhǔn)確的人體體內(nèi)檢材中卡西酮類毒品的定性定量檢測(cè)方法。目前尿液樣本中卡西酮類毒品的檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[3-4]、液相色譜-質(zhì)譜法（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）[5-6]及固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法[7]等，4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮的檢測(cè)方法[8-9]較少。本研究擬建立尿液樣本中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮的固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（solid phase extraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPE-GC-MS），用于卡西酮類毒品濫用者尿液中卡西酮類毒品的定性定量檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

甲卡西酮（1.0 mg/mL）、麻黃堿-d3（100 μg/mL）、4-甲基甲卡西酮（1.0 mg/mL）、4-甲基甲卡西酮-d3（100μg/mL）、3，4-亞甲二氧基甲卡西酮（1.0mg/mL）、3，4-亞甲二氧基甲卡西酮-d3（100 μg/mL）均購(gòu)自美國(guó)Cerilliant公司，七氟丁酸酐（heptafluorobutyric anhydride，HFBA）購(gòu)自美國(guó)Regis Technologies公司，色譜純甲醇與乙酸乙酯購(gòu)自德國(guó)MERCK公司，分析純鹽酸、冰乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉購(gòu)自廣州化學(xué)試劑廠，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）制得。

48位正壓固相萃取儀（帶氮?dú)獯蹈晒δ埽?、固相萃取小柱（CLIN-Ⅱ，691-0353）購(gòu)自美國(guó)SPEware公司，BZF-6020真空干燥箱購(gòu)自上海索譜儀器有限公司，7890氣相色譜儀、5975質(zhì)譜檢測(cè)器購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。

1.2 樣本及前處理

本研究卡西酮類毒品濫用者尿液樣本由山西省長(zhǎng)治市公安局提供。

取待檢尿液樣品100μL，加入0.9mL空白尿液樣品，加入磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）平衡。依次加入1mL甲醇、1mL去離子水、1mL磷酸鹽緩沖液（pH=6.0）活化固相萃取柱。將平衡好的尿液樣品加入固相萃取柱，自然流干；依次用2mL去離子水、1mL 0.1mol/L鹽酸洗滌雜質(zhì)，氮?dú)獯蹈? min；再加入2 mL甲醇洗滌雜質(zhì)，吹干5min。加入乙酸乙酯-氨水（體積比為98∶2）溶液2mL洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，氮?dú)?7℃吹干。加入 25 μL 乙酸乙酯和 25 μL HFBA，混勻，轉(zhuǎn)入鉗口進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，鉗緊，65℃加熱衍生20 min。待GC/MS分析。

1.3 儀器條件

色譜柱為DB-5MS柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），購(gòu)自美國(guó)Agilent公司。升溫程序：柱溫80℃保持1min；以50℃/min升至160℃，保持1min；以10℃/min升至180℃，保持3min；以80℃/min升至300℃，保持0.5 min。進(jìn)樣口溫度190℃，接口溫度300℃。不分流進(jìn)樣；載氣為氦氣，流速2.2 mL/min；進(jìn)樣量2 μL；電子能量為70 eV。采用選擇離子監(jiān)測(cè)（selected ion monitor，SIM）模式進(jìn)行定量分析。

1.4 方法學(xué)驗(yàn)證

1.4.1 特異性

取9份不同來(lái)源的空白尿液樣品，其中2份為僅加入內(nèi)標(biāo)物的空白尿液樣品，1份添加10μg/mL其他毒（藥）物成分（嗎啡、冰毒、大麻、美沙酮、巴比妥等常見(jiàn)毒品及藥物），按1.2節(jié)進(jìn)行前處理，按1.3節(jié)操作分析驗(yàn)證方法的特異性。

1.4.2 檢出限、定量限和線性

取空白尿液，加入甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成質(zhì)量濃度為0、1.0、2.0、3.0、5.0ng/mL的尿液樣品，加入內(nèi)標(biāo)物，按1.2節(jié)和1.3節(jié)方法進(jìn)行前處理和分析。信噪比大于3時(shí)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度即為本方法檢出限，信噪比大于10對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度即為本方法定量限[10]。

將甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白尿液中配制成質(zhì)量濃度為0、25、50、100、200 ng/mL 的樣品，再加入50 μL 1000ng/mL內(nèi)標(biāo)液按1.2節(jié)進(jìn)行前處理，按1.3節(jié)進(jìn)行分析。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值的比值為縱坐標(biāo)（y），繪制不強(qiáng)制過(guò)零點(diǎn)的一元線性方程，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。同時(shí)分5d做平行重復(fù)測(cè)試，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.4.3 精密度和準(zhǔn)確度

取空白尿液，配制成質(zhì)量濃度為50 ng/mL及150ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，每個(gè)質(zhì)量濃度配制6個(gè)樣品，連續(xù)5 d，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果計(jì)算該方法的日內(nèi)、日間精密度[以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）表示]以及準(zhǔn)確度。

1.4.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性

取空白尿液，按以下方法配制成質(zhì)量濃度為50 ng/mL和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品：在固相萃取前加入標(biāo)準(zhǔn)溶液（測(cè)得峰面積為A）、經(jīng)固相萃取后添加標(biāo)準(zhǔn)溶液于洗脫液（測(cè)得峰面積為B）、不做處理直接添加標(biāo)準(zhǔn)溶液（測(cè)得峰面積為C）。分別檢測(cè)上述3種前處理?xiàng)l件下樣品的峰面積，按照下列公式計(jì)算樣品前處理的回收率以及基質(zhì)效應(yīng)：

另外，取空白尿液配制50 ng/mL和100 ng/mL兩個(gè)質(zhì)量濃度水平3個(gè)平行的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，按照1.2節(jié)方法對(duì)樣品進(jìn)行前處理，分別在樣品處理當(dāng)天及室溫放置24 h后按1.3節(jié)方法進(jìn)行定量分析，確定24 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性。

2 結(jié)果和討論

2.1 特異性

空白尿液樣品在卡西酮類毒品衍生物出峰時(shí)間無(wú)干擾峰，方法的特異性較好。空白尿液及空白尿液中添加目標(biāo)物的總離子流圖見(jiàn)圖1～2?？ㄎ魍惗酒返谋Ａ魰r(shí)間及特征離子見(jiàn)表1。

圖1 空白尿液樣品的總離子流圖

圖2 空白尿液樣品添加卡西酮類毒品的總離子流圖

表1 卡西酮類化合物及內(nèi)標(biāo)物保留時(shí)間、特征離子及相對(duì)豐度

2.2 線性范圍、檢出限及定量限

尿液中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）＞0.99，檢出限均為2.0 ng/mL，定量限均為25.0ng/mL。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3 精密度和準(zhǔn)確度

本研究各待測(cè)物的準(zhǔn)確度為95.8%～107.7%，精密度為0.5%～5.7%，均滿足準(zhǔn)確度和精密度的要求。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性

本研究各待測(cè)物提取回收率為98.4%～105.7%，表明固相萃取的前處理方法可達(dá)到較好的萃取效果?；|(zhì)效應(yīng)均落在-5.4%～3.4%區(qū)間內(nèi)，固相萃取的方法對(duì)待測(cè)成分的抑制較低，給準(zhǔn)確定量提供了保障，內(nèi)標(biāo)法的回收率及基質(zhì)效應(yīng)均滿足要求。結(jié)果見(jiàn)表3。

50 ng/mL和100 ng/mL兩個(gè)質(zhì)量濃度3個(gè)平行的標(biāo)準(zhǔn)添加樣品，在24h后的測(cè)試值和當(dāng)天測(cè)試值相對(duì)誤差均小于5%。結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 尿液樣品中3種卡西酮類毒品的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限

表3 尿液樣品中3種卡西酮類毒品的精密度、準(zhǔn)確度、回收率和基質(zhì)效應(yīng) （%）

表4 尿液樣品中卡西酮類毒品固相萃取穩(wěn)定性 （n=3，±s，ng·mL-1）

表4 尿液樣品中卡西酮類毒品固相萃取穩(wěn)定性 （n=3，±s，ng·mL-1）

測(cè)試時(shí)間/h 0 24甲卡西酮50ng·mL-1 55.7±1.5 54.3±1.1 100ng·mL-1 95.1±2.3 96.8±3.4 4-甲基甲卡西酮50ng·mL-1 50.1±0.6 49.7±0.5 100ng·mL-1 98.6±0.5 96.8±0.6 3，4-亞甲二氧基甲卡西酮50ng·mL-1 50.2±0.8 49.8±0.3 100ng·mL-1 99.1±0.6 99.0±0.4

2.5 案例應(yīng)用

收集1例疑似卡西酮類毒品濫用者的尿液樣品，按1.2節(jié)方法進(jìn)行分析，在樣品中檢出甲卡西酮成分。采用內(nèi)標(biāo)法結(jié)合SIM模式進(jìn)行定量分析，定量結(jié)果為1582.0ng/mL，SIM色譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 甲卡西酮陽(yáng)性樣品的SIM色譜圖

3 結(jié) 論

本研究采用SPE-GC-MS方法建立了人體尿液樣本中甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮和3，4-亞甲二氧基甲卡西酮的定性定量檢測(cè)方法，同位素內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)物理化性質(zhì)接近，降低了目標(biāo)物在樣品前處理和儀器測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生的誤差，保證了定量的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。鑒于涉毒案例尿液中卡西酮類毒品的濃度范圍變化較大，高濃度陽(yáng)性樣品可通過(guò)空白尿液稀釋來(lái)彌補(bǔ)線性范圍不足的缺點(diǎn)。

本研究建立的方法準(zhǔn)確、靈敏，可用于卡西酮類毒品濫用者尿液中卡西酮類毒品的定性定量檢測(cè)分析。