全緣葉藍刺頭化學(xué)成分研究

裴 迪，木尼熱·艾蘭汗，波拉提·馬卡比力，張 濤，鄒忠梅*

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046；2.新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，自治區(qū)哈薩克醫(yī)藥研究所， 新疆 烏魯木齊 830004；4.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193 )

0 引言

菊科藍刺頭屬(EchinopsL.) 植物在全世界約有120余種，廣泛分布于南歐、北非和中亞地區(qū)，我國約有19種，主要分布于東北、西北等地區(qū)[1]. 藍刺頭屬植物是世界傳統(tǒng)醫(yī)藥的常用藥材，在我國中醫(yī)及民族醫(yī)藥中均有所使用. 在中醫(yī)藥中，禹州漏蘆是一種傳統(tǒng)中藥，從《中國藥典》1995年版起， 到 2015 年版等版本均收錄華東藍刺頭E.grijsiiHance及藍刺頭E.latifoliusTaush.的干燥根作為禹州漏蘆入藥. 在蒙醫(yī)藥中，驢欺口E.latifoliusTaush.的頭狀花序做藥用，主治骨折，骨熱，刺痛，瘡瘍；在維吾爾醫(yī)藥中，新疆藍刺頭E.ritroL. 用于治療腮腺炎、乳腺炎等；在哈薩克醫(yī)藥中，藍刺頭E.sphaerocephalusL.全草(含根)入藥，主治乳腺炎，腮腺炎，痛瘡，腫痛[2]. 研究表明，藍刺頭屬植物主要含有噻吩、黃酮、萜類(三萜和倍半萜)、生物堿、甾體、脂肪酸及芳香類，此外還有木脂素、內(nèi)酯、酰胺及香豆素等化學(xué)成分[3，4]，具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、 抗菌殺蟲、保肝、降血糖等多種藥理活性[5，6]，具有良好的開發(fā)前景.

我國藍刺頭屬植物化學(xué)成分研究最多的是華東藍刺頭E.grijsiiHance及藍刺頭E.latifoliusTaush.，在新疆分布的12種中，化學(xué)成分的研究主要集中于砂藍刺頭E.gmelinii Turcz.、硬葉藍刺頭E.ritroL.、藍刺頭E.sphaerocephalusL.及大藍刺頭E.talassicusGolosk等，其中全緣葉藍刺頭E.integrifoliusKar. et Kir.主要分布于新疆的青河、富蘊、福海、阿勒泰、布爾津、哈巴河等縣市，還分布于俄羅斯西伯利亞、哈薩克斯坦北部、蒙古西部[1]. 有報道全緣葉藍刺頭應(yīng)用于高血壓治療[7]. 2013年之前國內(nèi)外關(guān)于全緣葉藍刺頭化學(xué)成分及藥理活性的研究幾乎沒有，自2013年始，陸續(xù)有Senejoux F、孟繁桐、Makabel B等對其全株及地上部分進行化學(xué)成分研究，Karimov U對其根進行初步的化學(xué)成分研究，共分離到約31個化合物，其中約23個為首次從藍刺頭屬中分離得到，包括有藍刺頭屬前人沒有分到的酰胺類、苯醌類和香豆素類[7-11]. 因此，本文對全緣葉藍刺頭的根進行化學(xué)成分研究.

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

儀器：Bruker AVANCE III500型核磁共振儀，德國Bruker公司；JY02S型紫外分析儀，北京君意設(shè)備有限公司；X6型顯微熔點測定儀，北京泰克儀器有限公司；LTQ Orbitrap XL spectrometer 質(zhì)譜儀，美國Thermo公司；EYELA N-1100V-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社；真空隔膜泵，德國ILMVAC公司；SHB-B型循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；LC3000高效液相色譜儀，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司.

試劑：薄層色譜硅膠(GF254)和柱色譜硅膠(60～100目、100～200目、200～300目及300～400目)均為青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；Sephadex LH-20 ，瑞典GE Health care公司；高效液相用甲醇為色譜甲醇，天津賽孚瑞科技有限公司. 其余試劑均為分析純，北京化工廠.

材料：藥材來源為2011年7月采自新疆阿勒泰，由新疆阿勒泰地區(qū)藥品檢驗所巴哈爾古麗·黃爾汗鑒定為全緣葉藍刺頭(EchinopsintegrifoliusKar. et Kir.).

1.2 提取與分離

植物化學(xué)研究過程中，使用不同體積分數(shù)的乙醇將化學(xué)成分從植物樣品中提取(溶解)出來，然后采用不同極性的溶劑將提取出的化學(xué)成分萃取為幾個部分，實現(xiàn)化學(xué)成分的初步分離. 根據(jù)極性不同，采用硅膠柱層析，將每個部分繼續(xù)分離為不同極性段，然后再經(jīng)過反復(fù)硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、重結(jié)晶及制備薄層色譜等分離手段將化學(xué)成分分離并最終純化. 對于一些中高極性的化學(xué)成分，可使用高效液相進行分離純化.

將全緣葉藍刺頭的干燥根6.6 kg粉碎后，依次用10倍量體積分數(shù)95%、50% 的乙醇各提取2次，合并提取液，濾過，濾液減壓濃縮干燥后得浸膏568 g. 浸膏加蒸餾水適量混懸，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇進行萃取，得到石油醚部位81 g，乙酸乙酯部位34 g. 取石油醚萃取物80 g進行硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(100∶10～0∶1)梯度洗脫，得到A～J共9個組分. Fr.D進行硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(100∶0～1∶1)梯度洗脫，得到5個組分(Fr.D1～D5)，F(xiàn)r.D3經(jīng)制備薄層色譜純化得到化合物1(3 mg). Fr.G進行硅膠柱色譜，石油醚-丙酮(100∶0～3∶1)梯度洗脫，得到6個組分(Fr.G1～G6)，F(xiàn)r.G2再經(jīng)反復(fù)的硅膠柱色譜純化得到化合物2(11 mg)，F(xiàn)r.H進行硅膠柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(100∶0～0∶1)梯度洗脫得到5個組分(Fr.H1～H5)，F(xiàn)r.H3以石油醚-乙酸乙酯(100∶0～0∶1)梯度洗脫及重結(jié)晶得到化合物3(105 mg). 乙酸乙酯萃取物進行硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇(100∶0～0∶1)梯度洗脫，得到K～Q共7個組分. Fr.K經(jīng)Sephadex LH-20及半制備HPLC等純化得到化合物4(8 mg)和化合物5(3 mg)，F(xiàn)r.L經(jīng)Sephadex LH-20得到3個組分(Fr.L1～L3)，F(xiàn)r.L2進行硅膠柱色譜，石油醚-丙酮(10∶1～0∶1)梯度洗脫后經(jīng)半制備HPLC等度洗脫制備得到化合物6(12 mg). Fr.M經(jīng)Sephadex LH-20得到3個組分(Fr.M1～M3)，F(xiàn)r.M2進行硅膠柱色譜，二氯甲烷-甲醇(25∶1～0∶1)梯度洗脫得到3個組分(Fr.M21～M23)Fr.M22經(jīng)Sephadex LH-20及半制備HPLC等純化得到化合物7(6 mg).

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，Tmp207 ℃～209 ℃，紫外燈365 nm下顯橘黃色熒光.1H-NMR (500 MHz, Chloroform-d)譜顯示有12個質(zhì)子信號：低場區(qū)δ: 12.32 (1H, s, -OH), 12.13 (1H, s, -OH)推測是和同一羰基締合的兩個苯環(huán)上的羥基質(zhì)子信號，δ: 7.38 (1H, d,J= 2.5 Hz, H-5), 6.69 (1H, d,J= 2.5 Hz, H-7)推測是苯環(huán)上兩個間位偶合的氫質(zhì)子信號，δ: 7.63 (1H, br.s, H-4), 7.09 (1H, br.s, H-2)推測是兩個互為間位的氫質(zhì)子信號，δ: 3.94 (3H, s, -OCH3)推測是連接在苯環(huán)上的甲氧基質(zhì)子信號，δ: 2.45 (3H, s, -CH3)是連接在苯環(huán)上的甲基質(zhì)子信號；13C NMR (125 MHz, Chloroform-d)譜顯示16個碳信號：苯環(huán)區(qū)含14個碳信號：δ: 190.8 (C-9), 182.1 (C-10), 166.5 (C-6), 165.2 (C-1), 162.5 (C-8), 148.5 (C-3), 135.3 (C-11), 133.2 (C-14), 124.5 (C-2), 121.3 (C-4), 113.7 (C-13), 110.3 (C-12), 108.2 (C-5), 106.8 (C-7), 其中δ: 190.8, 182.1 為羰基碳信號，說明是蒽醌類化合物，δ: 166.5,165.2及162.5是苯環(huán)上連氧碳信號，驗證了上述兩個羥基一個甲氧基取代的推斷，δ: 56.1為甲氧基碳信號，δ: 22.2為甲基碳信號，綜合上述信息，將以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[12]報道的大黃素甲醚對照，基本一致，故鑒定化合物1為大黃素甲醚.

化合物2：黃色粉末.1H-NMR (500 MHz, Chloroform-d) 譜中δ: 5.20 (1H, br.s, H-15a), 5.05 (1H, br.s, H-15b), 4.86 (1H, s, H-14a), 4.77 (1H, s, H-14b)為烯氫質(zhì)子信號，δ: 4.03 (1H, t,J= 9.6 Hz, H-6)為連氧碳上的質(zhì)子信號，δ: 1.16 (3H, d,J= 7.8 Hz, H-13)為甲基質(zhì)子信號，其他質(zhì)子信號δ: 2.89 (1H, m, H-1), 2.82 (1H, t,J= 9.0 Hz, H-5), 2.67 (1H, m, H-11)；13C-NMR (125 MHz, Chloroform-d)譜中δ: 180.1 (C-12)為羰基碳信號，δ: 151.9 (C-4), 150.2 (C-10), 111.8 (C-14), 109.5 (C-15)為烯碳信號，δ: 85.3 (C-6)為連氧碳信號，δ: 37.6 (C-8), 32.6 (C-9), 30.2 (C-3), 29.8 (C-2)為環(huán)烷烴亞甲基碳信號，δ: 11.5 (C-13)為甲基碳信號，其他碳信號：δ: 52.3 (C-7), 47.1 (C-1), 45.0 (C-5), 39.5 (C-11)，綜合上述信息，將以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[13]報道的(+)-11α,13-二氫去氫木香內(nèi)酯對照，基本一致，故鑒定化合物2為(+)-11α,13-二氫去氫木香內(nèi)酯.

化合物3：白色針狀結(jié)晶(二氯甲烷)，Tmp165 ℃～167 ℃，TLC遇10%硫酸乙醇(105 ℃)顯紫紅色. Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽性. 與豆甾醇標準品在三個溶劑系統(tǒng)下共薄層Rf值相同，且混合熔點不下降，故鑒定化合物3為豆甾醇.

化合物4：淡黃色結(jié)晶(甲醇)，Tmp226 ℃～227 ℃，紫外燈254 nm及365 nm下有藍色熒光，初步推測可能為香豆素類化合物.1H-NMR (500 MHz, Methanol-d4) 譜中δ: 7.84 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-4), 6.18 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-3)為香豆素基本骨架3,4位質(zhì)子信號峰，δ: 7.45 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5), 6.79 (1H, dd,J= 8.5, 2.2 Hz, H-6), 6.71 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-8)為ABX 偶合系統(tǒng)的苯環(huán)質(zhì)子信號. HR-ESI-MS (pos.):m/z163.0387 [M+H]+，說明其分子量為162. 綜合上述信息，將以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[14]報道的7-羥基香豆素對照，基本一致，故鑒定化合物4為7-羥基香豆素.

化合物5：淡黃色結(jié)晶(甲醇)，Tmp203 ℃～204 ℃,紫外燈254 nm及365 nm下有藍色熒光，初步推測可能為香豆素類化合物.1H-NMR (500 MHz, Methanol-d4) 譜中δ: 7.85 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-4),6.19 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-3)為香豆素基本骨架3,4位質(zhì)子信號峰，δ: 7.10 (1H, s, H-5), 6.76 (1H, s, H-8)為兩個孤立氫信號峰，δ: 3.90 (3H, s, 6-OCH3) 為甲氧基氫信號峰. HR-ESI-MS (pos.):m/z215.0314 [M+Na]+，說明其分子量是192. 綜合上述信息，將以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[15]報道的東莨菪素對照，基本一致，故鑒定化合物5為東莨菪素.

化合物6：白色結(jié)晶(甲醇)，Tmp213 ℃～214 ℃,紫外燈254 nm下有暗斑，365 nm下無熒光，10%硫酸乙醇(105 ℃)不顯色.1H-NMR (500 MHz, Methanol-d4) 譜中δ: 7.88 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2,6), 6.82 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3,5)為對位取代苯環(huán)的特征信號；13C-NMR (125 MHz, Methanol-d4)譜中δ: 170.2 (-COOH)為羧基碳信號，δ: 163.3 (C-4), 133.0 (C-2,6), 122.8 (C-1), 116.0 (C-3,5) 為6個芳香碳信號，綜合上述信息，將以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[16]報道的對羥基苯甲酸對照，基本一致，故鑒定化合物6為對羥基苯甲酸.

化合物7：白色粉末，Tmp206 ℃～207 ℃，紫外燈365 nm下有藍色熒光.1H- NMR (500 MHz, Methanol-d4) 譜中δ: 7.90 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-4), 6.29 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-3)為香豆素基本骨架3,4位質(zhì)子信號峰，δ: 7.57 (1H, d,J= 9.2 Hz, H-5), 7.09 (1H, d,J= 9.0 Hz, H-6), 7.08 (1H, s, H-8)為苯環(huán)上的質(zhì)子信號，δ: 5.04 (1H, d,J= 7.5 Hz, H-1')為葡萄糖基上的端基質(zhì)子信號，δ: 3.91 (1H, dd,J= 12.1, 2.3 Hz, H-6'a), 3.71 (1H, dd,J= 12.0, 5.7 Hz, H-5'), 3.46 ～3.55 (3H, m, H-2', 3', 6'b), 3.38～3.42 (1H, m, H-4')為葡萄糖基上的質(zhì)子信號；13C-NMR (125 MHz, Methanol-d4) 譜中δ: 163.1 (C-2)為羰基碳信號，δ: 162.2 (C-7), 156.7 (C-9), 145.6 (C-4), 130.4 (C-5), 115.3 (C-6), 115.2 (C-10), 114.3 (C-3), 105.0 (C-8)為四對雙鍵碳信號，δ: 101.9 (C-1'), 78.4 (C-3'), 77.9 (C-5'), 74.8 (C-2'), 71.3 (C-4'), 62.5 (C-6') 為葡萄糖基上的六個碳信號，綜合上述信息，將以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[17]報道的茵芋苷對照，基本一致，故鑒定化合物7為茵芋苷.

2.2 討論

化合物1具有多種藥理作用，文獻報道主要涉及對缺血、缺氧腦損傷或缺血-再灌注腦損傷的神經(jīng)保護活性，其化學(xué)修飾后的衍生物也具有抗腫瘤活性[18]. 化合物2為倍半萜內(nèi)酯，天然來源的倍半萜內(nèi)酯在菊科植物中分布最為廣泛，其中有些化合物具有抗腫瘤等多種生物活性，陳進軍等[19]研究表明二氫去氫木香內(nèi)酯在高濃度(100 μmol/L)下對人子宮頸癌細胞和人腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖具有中等程度的抑制作用. 化合物4、5和7為香豆素類化合物，在藍刺頭屬植物中，均只在該種被發(fā)現(xiàn)，因其具有多種生物活性及熒光性能而被廣泛應(yīng)用在醫(yī)藥、燃料和光學(xué)材料領(lǐng)域；化合物5具有抗腫瘤、防治高尿酸血癥、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血壓及解痙等廣泛的藥理活性，由于其天然來源量低，價格昂貴，故而有人工合成以用于深入研究[20]；化合物7具有治療腎功能不全方面的活性，與Benazepril和Losartan等進口、價格昂貴及毒副作用較大等治療腎功能不全的藥物具有相似功效，但是其在植物中含量有限，提取分離成本高，薛清春等[21]設(shè)計并實現(xiàn)了其的化學(xué)合成.

3 結(jié)論

本實驗從全緣葉藍刺頭的根部分離得到7個化合物，其中化合物6為首次從全緣葉藍刺頭中分離得到，化合物1、2、5 和7為首次從藍刺頭屬中分離得到. 本項工作豐富了藍刺頭屬的化學(xué)成分，增加了化學(xué)成分的天然來源，為后續(xù)的活性研究及化合物的衍生化奠定了物質(zhì)基礎(chǔ).