上皮性卵巢癌組織中CD44、Nanog的表達(dá)及臨床意義

杜文升 魏敏

[摘要] 目的 探討上皮性卵巢癌組織中CD44、轉(zhuǎn)錄因子Nanog的表達(dá)水平及其臨床意義。 方法 收集2012年1～12月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院行手術(shù)治療的80例上皮性卵巢癌患者的卵巢組織標(biāo)本為病例組，并于同期隨機(jī)選取60例良性卵巢腫瘤患者卵等組織標(biāo)本為對照組。采用免疫組織化學(xué)法檢測各組標(biāo)本中CD44、Nanog的表達(dá)水平。 結(jié)果 病例組CD44、Nanog陽性表達(dá)率均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <; 0.05）。腫瘤直徑≥3 cm、腫瘤低分化、浸潤深度T3+T4期、FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌患者組織中CD44、Nanog陽性表達(dá)率高于腫瘤直徑<;3 cm、中高分化、浸潤深度T1+T2期、FIGO分期Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <; 0.05）。Spearman秩相關(guān)分析顯示病例組患者組織中CD44與Nanog表達(dá)呈正相關(guān)（rs = 0.592，P <; 0.05）。CD44陽性表達(dá)者5年生存率低于CD44陰性者，Nanog陽性表達(dá)者5年生存率低于Nanog陰性者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <; 0.05）。 結(jié)論 CD44、Nanog表達(dá)上調(diào)參與了上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，早期檢測可作為臨床輔助診斷上皮性卵巢癌、評估病情嚴(yán)重程度及預(yù)測預(yù)后的重要標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞] 上皮性卵巢癌;CD44;Nanog;臨床意義

[中圖分類號] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（b）-0082-05

[Abstract] Objective To explore the expression levels of CD44 and transcription factor Nanog in tissues with epithelial ovarian cancer and its clinical significance. Methods A total of 80 ovarian tissues of patients with epithelial ovarian cancer treated by operation in Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University from January to December 2012 were collected as case group. At the same time， 60 ouarian tissues of patients with benign ovarian tumors were randomly selected as control group. The expression levels of CD44 and Nanog of two groups were detected by immunohistochemistry. Results The positive expression rate of CD44 and Nanog in case group were both higher than the control group， the differences were statistically significant （P <; 0.05）. The positive rate in patients with tumor diameter ≥ 3 cm， low differentiation， T3+T4 stage of infiltration depth， FIGO stage Ⅲ+Ⅳ， lymph node metastasis were higher than those with tumor diameter <;3 cm， medium and high differentiation， T1+T2 stage of infiltration depth， FIGO stage Ⅰ+Ⅱ， no lymph node metastasis， the differences were statistically significant （P <; 0.05）. Spearman rank correlation analysis showed that a positive correlation between CD44 and Nanog expression in case group was found （rs = 0.592， P <; 0.05）. The 5-year survival rate in patients with CD44 positive expression was lower than that in patients with CD44 negative expression， and the 5-year survival rate in patients with Nanog positive expression was lower than that in patients with Nanog negative expression， the differences were statistically significant （P <; 0.05）. Conclusion The up-regulated expression of CD44 and Nanog is involved in the occurrence and development of epithelial ovarian cancer. Early detection of CD44 and Nanog can be used as an important markers for diagnosing epithelial ovarian cancer and evaluating the severity of disease and predicting prognosis.

[Key words] Epithelial ovarian cancer; CD44; Nanog; Clinical significance

上皮性卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占卵巢惡性腫瘤的85%～90%，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌，死亡率居?jì)D科惡性腫瘤首位[1]。早期診斷困難，確診時(shí)已近中晚期，患者5年生存率僅為30%～40%[2]。因此，尋找靈敏度高、特異性好的標(biāo)志物輔助臨床診斷并評估病情嚴(yán)重程度具有重要意義。CD44屬于細(xì)胞黏附分子家族成員，是一種跨膜糖蛋白，在細(xì)胞間或者細(xì)胞與基質(zhì)間以跨膜糖蛋白方式發(fā)揮作用，CD44與細(xì)胞黏附、血管形成、腫瘤細(xì)胞浸潤及增殖密切相關(guān)[3]。研究顯示[4-5]，CD44表達(dá)異常參與了胃癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)病過程。Nanog是主要在多能胚胎干細(xì)胞中呈高表達(dá)而發(fā)揮維持胚胎干細(xì)胞多潛能性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)[6]，Nanog可能是癌變起源的靶細(xì)胞，其高表達(dá)對腫瘤的發(fā)生有促進(jìn)作用。關(guān)于CD44、Nanog表達(dá)與上皮性卵巢癌發(fā)病的關(guān)系，目前相關(guān)研究相對較少，本研究旨在探討其關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2012年1～12月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡稱“我院”）手術(shù)切除的80例上皮性卵巢癌患者的卵巢組織標(biāo)本為病例組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①組織標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)確診為上皮性卵巢癌;②首次手術(shù)且術(shù)前未接受任何放、化療，也未行腫瘤免疫治療者;③臨床病理資料完整，且隨訪資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕產(chǎn)婦及哺乳期的婦女;②心臟功能不全者;③肝、腎功能障礙者;④術(shù)前6個(gè)月內(nèi)服用過雌、孕激素類藥物者;⑤其他惡性腫瘤患者。患者年齡34～76歲，平均（56.8±13.3）歲;腫瘤直徑2.6～8.3 cm，平均（5.3±1.6）cm;腫瘤病理類型：局限型47例，浸潤型33例;病理類型：漿液性53例，黏液性27例;腫瘤分化程度：低分化51例，中、高分化29例;國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期標(biāo)準(zhǔn)[7]：Ⅰ+Ⅱ期46例，Ⅲ+Ⅳ期34例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。并于同期隨機(jī)選取60例于我院行卵巢腫瘤切除術(shù)的良性卵巢腫瘤患者的卵巢組織標(biāo)本為對照組，患者年齡29～75歲，平均（54.9±14.5）歲。兩組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >; 0.05），具有可比性。本研究得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，研究對象及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑 SP免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、DAB顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）;一抗兔抗人CD44單克隆抗體（英國Abcam公司）、一抗兔抗人Nanog多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗）抗體（北京中杉金橋生物科技有限公司）。

1.2.2 免疫組化 對卵巢組織切片進(jìn)行包埋，二甲苯和酒精脫蠟后以蒸餾水漂洗5 min，常溫環(huán)境下以濃度為3%的H2O2滅活10 min，水洗;以乙二胺四乙酸（EDTA）稀釋10倍后在微波爐下大火煮7～8 min，在室溫下冷卻5 min，再以大火煮7～8 min，通過微波進(jìn)行熱修復(fù)，冷卻30 min直至其恢復(fù)至室溫，滴加濃度為5%的牛血清白蛋白（BSA），在37℃恒溫箱中孵育，30 min后做封閉處理;滴加一抗后在37℃恒溫箱中孵育2 h，以磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌5 min，反復(fù)3次;抗體稀釋的濃度為1∶100;滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG在37℃恒溫箱中孵育30 min，再以PBS洗滌5 min，反復(fù)3次;滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（SABC），并在37℃恒溫箱中孵育30 min，以PBS洗滌5 min，反復(fù)3次;DAB顯色后復(fù)染，返藍(lán)后封片處理，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。上述操作嚴(yán)格按照免疫組化SP試劑盒上的說明書進(jìn)行。

1.2.3 結(jié)果判定 CD44陽性染色細(xì)胞在細(xì)胞膜中表達(dá)，Nanog陽性染色細(xì)胞主要在細(xì)胞核中表達(dá)，少部分在細(xì)胞漿中表達(dá)，陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度判定根據(jù)陽性染色細(xì)胞所占的百分比與染色強(qiáng)度計(jì)算[8-9]：在光鏡下，隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野計(jì)算1000個(gè)細(xì)胞中陽性染色細(xì)胞所占的百分比：陽性染色細(xì)胞數(shù)所占的百分比<;5%記為0分，5%～25%記為1分，>;25%～50%記為2分，>;50%～75%記為3分，>;75%則記為4分;根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行評分，染色呈淡黃色計(jì)為1分，染色呈棕黃色計(jì)為2分，染色呈棕褐色計(jì)為3分。兩種評分的乘積則為最終陽性強(qiáng)度評分，最終積分≤3分計(jì)為陰性（-），>;3分計(jì)為陽性（+）。

1.3 隨訪

術(shù)后對患者進(jìn)行隨訪，隨訪方式包括電話隨訪或者門診隨訪，隨訪結(jié)局為患者3、5年生存情況，隨訪期限為術(shù)后5年。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);采用Spearman秩相關(guān)分析CD44與Nanog之間的相關(guān)性。以P <; 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者卵巢組織標(biāo)本中CD44、Nanog表達(dá)水平比較

病例組患者卵巢組織中CD44、Nanog陽性表達(dá)率均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <; 0.05）。見表1。

2.2 病例組患者卵巢組織中CD44、Nanog表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

上皮性卵巢癌患者卵巢組織中CD44、Nanog的表達(dá)與腫瘤直徑、腫瘤分化程度、腫瘤浸潤深度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <; 0.05）。見表2。

2.3 病例組患者卵巢組織中CD44、Nanog表達(dá)的相關(guān)性分析

經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，病例組患者組織中CD44與Nanog表達(dá)呈正相關(guān)（rs = 0.592，P <; 0.05）。

2.4 CD44、Nanog不同陽性表達(dá)強(qiáng)度的上皮性卵巢患者預(yù)后分析

CD44、Nanog陽性表達(dá)者與陰性表達(dá)者3年生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >; 0.05）;CD44陽性表達(dá)者5年生存率低于CD44陰性組，Nanog陽性表達(dá)組5年生存率低于Nanog陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <; 0.05）。見表3。

3 討論

CD44是廣泛存在于細(xì)胞之間的跨膜糖蛋白，屬于黏附分子家族成員，通過特異性結(jié)合透明質(zhì)酸而參與淋巴細(xì)胞的歸巢、淋巴細(xì)胞向黏膜相關(guān)淋巴組織以及炎癥部位轉(zhuǎn)移等，并介導(dǎo)細(xì)胞之間或者細(xì)胞與基質(zhì)之間的特異性黏附過程[10]。研究顯示[11]，CD44與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，其機(jī)制主要包括：惡性腫瘤細(xì)胞之間的同質(zhì)型黏附作用減弱，異質(zhì)型黏附性明顯增強(qiáng)，其中減弱的同質(zhì)型黏附使原發(fā)灶的腫瘤細(xì)胞脫離，增強(qiáng)的異質(zhì)型黏附促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞借助黏附作用發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。李威等[12]研究發(fā)現(xiàn)，CD44參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，并且與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)密切相關(guān)，是預(yù)測胃癌預(yù)后的重要標(biāo)志物。此外，研究表明CD44還介導(dǎo)了乳腺癌[13]、鼻咽癌[14]等惡性腫瘤的發(fā)病過程。

Nanog是胚胎干細(xì)胞中的特異性表達(dá)基因，主要在早期胚胎以及生殖干細(xì)胞中表達(dá)，其功能包括維持胚胎干細(xì)胞的自我更新以及多向分化。Nanog分子氨基端含有的蘇氨酸、絲氨酸以及脯氨酸等，其在磷酸化作用下可被修飾，而羧基端則具有轉(zhuǎn)錄激活的功能[15]。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者組織中Nanog異常表達(dá)，敲除Nanog基因后可抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲。研究顯示[17-18]，Nanog表達(dá)上調(diào)參與了乳腺癌、直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且與腫瘤細(xì)胞的浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。另有研究報(bào)道[19]，Nanog表達(dá)上調(diào)對預(yù)測食管癌患者生存時(shí)間有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，病例組患者卵巢組織中CD44、Nanog陽性表達(dá)率高于對照組，提示CD44、Nanog通過異常表達(dá)而參與上皮性卵巢癌的發(fā)病過程。腫瘤大小及其臨床分期、組織的分化程度、腫瘤浸潤組織的深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均反映了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，并且與病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)，腫瘤越大及浸潤組織越深，臨床分期越晚，組織分化程度越低，有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者病情越嚴(yán)重。本研究結(jié)果中，上皮性卵巢癌患者組織中CD44、Nanog異常表達(dá)與腫瘤大小及臨床分期、組織分化程度、腫瘤浸潤深度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腫瘤直徑≥3 cm、腫瘤低分化、浸潤深度T3+T4期、FIGO分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中CD44、Nanog表達(dá)陽性率明顯升高，即患者惡性程度越高，CD44、Nanog表達(dá)陽性率越高，提示CD44、Nanog介導(dǎo)了上皮性卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程，是評估病情嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)，與有關(guān)研究結(jié)果相似[2，20]。

Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，上皮性卵巢癌患者組織中CD44與Nanog表達(dá)呈正相關(guān)，提示兩者促癌作用具有協(xié)同性，通過相互促進(jìn)共同介導(dǎo)上皮性卵巢癌的發(fā)病過程，但是其作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。馬琳等[11]研究發(fā)現(xiàn)，CD44陽性表達(dá)是預(yù)測卵巢癌患者5年生存率的危險(xiǎn)因素，CD44陽性表達(dá)越強(qiáng)，患者5年生存率越低。李秀娟等[19]發(fā)現(xiàn)，Nanog表達(dá)陽性的食管癌患者5年生存率低于Nanog陰性表達(dá)者。本研究中，CD44陽性表達(dá)者5年生存率低于CD44陰性者，Nanog陽性表達(dá)者5年生存率低于Nanog陰性表達(dá)者，而CD44、Nanog陽性表達(dá)者與陰性表達(dá)者3年生存率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >; 0.05），提示CD44、Nanog表達(dá)上調(diào)與上皮性卵巢癌患者生存時(shí)間有關(guān)，兩者可作為預(yù)測患者遠(yuǎn)期預(yù)后的標(biāo)志物。

綜上所述，CD44、Nanog通過表達(dá)上調(diào)而參與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程，兩者通過協(xié)調(diào)作用而發(fā)揮促癌功能，并且其與患者病情進(jìn)展及遠(yuǎn)期預(yù)后密切相關(guān)，早期檢測對輔助臨床診斷上皮性卵巢、評估病情嚴(yán)重程度和判斷預(yù)后有重要價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 于斯雯，韓世愈.卵巢癌干細(xì)胞標(biāo)記物的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2018，26（10）：1626-1629.

[2] 侯小滿，林雪艷，田永杰.CD44和NANOG在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國病理生理雜志，2018， 34（3）：549-554.

[3] 黃遠(yuǎn)見，李巧云，肖娟.轉(zhuǎn)染反義CD44對人鼻咽癌細(xì)胞的影響[J].臨床合理用藥雜志，2018，11（14）：144-145.

[4] Senel F，Kokenek Unal TD，Karaman H，et al. Prognostic value of cancer stem cell markers CD44 and ALDH1/2 in gastric cancer cases [J]. Asian Pac J Cancer Prev，2017， 18（9）：2527-2531.

[5] Hu B，Ma Y，Yang Y，et al. CD44 promotes cell proliferation in non-small cell lung cancer [J]. Oncol Lett，2018， 15（4）：5627-5633.

[6] Md Akhir MKA，Hussin H，Veerakumarasivam A，et al. Immunohistochemical expression of NANOG in urothelial carcinoma of the bladder [J]. Malays J Pathol，2017，39（3）：227-234.

[7] Shrivastava S，Mahantshetty U，Engineer R，et al. Cisplatin chemoradiotherapy vs radiotherapy in FIGO Stage ⅢB squamous cell carcinoma of the uterine cervix：a randomized clinical trial [J]. JAMA Oncol，2018，4（4）：506-513.

[8] Motohara T，F(xiàn)ujimoto K，Tayama S，et al. CD44 variant 6 as a predictive biomarker for distant metastasis in patients with epithelial ovarian cancer [J]. Obstet Gynecol，2016， 127（6）：1003-1011.

[9] Elzarkaa AA，Sabaa BE，Abdelkhalik D，et al. Clinical relevance of CD44 surface expression in advanced stage serous epithelial ovarian cancer：a prospective study [J]. J Cancer Res Clin Oncol，2016，142（5）：949-958.

[10] Sacks JD，Barbolina MV. Expression and Function of CD44 in Epithelial Ovarian Carcinoma [J]. Biomolecules，2015， 5（4）：3051-3066.

[11] 馬琳，劉杏巧，張志革，等.CD44及Lgr5在卵巢癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性分析[J].標(biāo)記免疫分析與臨床，2017，24（10）：1175-1179，1186.

[12] 李威，姜波健，俞繼衛(wèi).CD44與CD133蛋白在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志，2014，21（1）：21-28.

[13] Wang Z，Wang Q，Wang Q，et al. Prognostic significance of CD24 and CD44 in breast cancer：a meta-analysis [J]. Int J Biol Markers，2017，32（1）：e75-e82.

[14] Sagawa K，Uwa N，Daimon T，et al. Expression of CD44 variant isoforms，CD44v3 and CD44v6，are associated with prognosis in nasopharyngeal carcinoma [J]. J Laryngol Otol，2016，130（9）：843-849.

[15] Wang H，Liu B，Wang J，et al. Reduction of NANOG mediates the inhibitory effect of Aspirin on tumor growth and stemness in colorectal cancer [J]. Cell Physiol Biochem，2017，44（3）：1051-1063.

[16] Liu S，Sun J，Cai B，et al. NANOG regulates epithelial-mesenchymal transition and chemoresistance through activation of the STAT3 pathway in epithelial ovarian cancer [J]. Tumour Biol，2016，37（7）：9671-9680.

[17] Almozyan S，Colak D，Mansour F，et al. PD-L1 promotes OCT4 and Nanog expression in breast cancer stem cells by sustaining PI3K/AKT pathway activation [J]. Int J Cancer，2017，141（7）：1402-1412.

[18] You L，Guo X，Huang Y. Correlation of cancer stem-cell markers OCT4，SOX2，and NANOG with clinicopathological features and prognosis in operative patients with rectal cancer [J]. Yonsei Med J，2018，59（1）：35-42.

[19] 李秀娟，趙軼峰，李明霞，等.食管鱗癌組織Nanog表達(dá)臨床意義分析[J].中華腫瘤防治雜志，2014，21（24）：1962-1965.

[20] Tjhay F，Motohara T，Tayama S，et al. CD44 variant 6 is correlated with peritoneal dissemination and poor prognosis in patients with advanced epithelial ovarian cancer [J]. Cancer Sci，2015，106（10）：1421-1428.

（收稿日期：2018-05-17 本文編輯：任 念）