載脂蛋白E基因多態(tài)性與房性心律失常的關(guān)系

聶娣 婁煥堃 邢團(tuán)結(jié) 梅佳慧 王勛 李鵬 王飛翔 汪明瑯 王怡練

1 連云港市灌云縣人民醫(yī)院心血管內(nèi)科（江蘇灌云222202）；2連云港市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科（江蘇連云港222006）

房性心律失常在臨床上較常見(jiàn)，包括房性期前收縮、房性心動(dòng)過(guò)速、心房撲動(dòng)和心房顫動(dòng)。先天遺傳、后天生活環(huán)境及生活方式等諸多因素都是房性心律失常的病因。年齡、吸煙、高血壓、血脂異常、動(dòng)脈粥樣硬化、肥胖及多種心血管疾?。?］導(dǎo)致的心臟電重構(gòu)和心肌重構(gòu)等一直以來(lái)被認(rèn)為是房性心律失常重要的發(fā)病機(jī)制。過(guò)度的氧化應(yīng)激和全身性炎癥是房性心律失常發(fā)生和維持的重要機(jī)制，二者會(huì)在很大程度上加重血管內(nèi)皮損傷、使心肌纖維化發(fā)生或進(jìn)展，心肌細(xì)胞受到損傷，進(jìn)而出現(xiàn)心房增大，最終導(dǎo)致心臟的結(jié)構(gòu)重構(gòu)、電重構(gòu)。

載脂蛋白E（ApoE）是SHORE［2］最先發(fā)現(xiàn)的一種由299 個(gè)氨基酸組成的糖蛋白，是血漿中的一種特殊的多態(tài)性脂蛋白，主要參與體內(nèi)脂蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、儲(chǔ)存、利用及排泄。ApoE 基因型可分為三大種類：ε2/ε2、ε2/ε3 被稱為保護(hù)類基因型；ε2/ε4、ε3/ε3 更為多見(jiàn)，稱為大眾類基因型；含有ε4 等位基因的ε3/ε4、ε4/ε4 稱為風(fēng)險(xiǎn)類基因型；分別對(duì)應(yīng)ApoE2、ApoE3、ApoE4 三種基因表型，與多種疾病有關(guān)［3］。

研究表明，ApoE 具有調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)分泌及抵抗氧化應(yīng)激的作用，HAYEK 等［4］最先發(fā)現(xiàn)ApoE 具有抗氧化、抗炎作用，且ApoE 不同等位基因抗炎能力大小不同［5］。

正是基于ApoE 與上述機(jī)制存在關(guān)聯(lián)，因此本研究推測(cè)ApoE 基因多態(tài)性對(duì)房性心律失常的發(fā)生發(fā)展有重要影響。本研究通過(guò)分析ApoE 基因多態(tài)性與房性心律失常的相關(guān)性，進(jìn)一步探討ApoE 基因?qū)Ψ啃孕穆墒С５挠绊憽?/p>

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

1.1.1 臨床病例 選取2019年1月至2020年6月在連云港市灌云縣人民醫(yī)院、連云港市第二人民醫(yī)院心血管內(nèi)科就診的（房早35 例、房速15 例、房撲20 例、房顫50 例）共120 例患者為房性心律失常組及同期門診健康志愿者（竇性心律）120 例為對(duì)照組，其中房性心律失常組男63 例，女57 例，平均（74.57±8.12）歲；對(duì)照組男59 例，女61 例，平均（65.67±12.46）歲。

1.1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)明確的心電圖或動(dòng)態(tài)心電圖資料結(jié)合臨床癥狀和病史確診房性心律失常者；有完整的病歷資料和血標(biāo)本；所有入選病例均簽署知情同意書。房性早搏＞100 次/24 h 或伴多源房早、成對(duì)、呈聯(lián)律；房性心動(dòng)過(guò)速簡(jiǎn)稱為房速，短陣自限性不納入本研究；心房顫動(dòng)診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)心電生理和起搏分會(huì)、中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)心律學(xué)專業(yè)委員會(huì)心房顫動(dòng)防治專家工作委員會(huì)制定的《心房顫動(dòng)：目前的認(rèn)識(shí)和治療建議（2018）》。

1.1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 左心功能不全、肺源性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、擴(kuò)張型心肌病、肥厚型心肌病、病毒性心肌炎、既往心臟手術(shù)史、繼發(fā)性高血壓、甲亢、電解質(zhì)紊亂、惡性腫瘤、肝腎功能不全等疾??；嚴(yán)重感染、結(jié)核、代謝綜合征；無(wú)知情同意書。

1.2 臨床資料

1.2.1 一般資料年齡、性別、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史；

1.2.2 心臟超聲 左心房?jī)?nèi)徑及左心室射血分?jǐn)?shù)等參數(shù)由超聲科特定人選完成測(cè)定。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器 擴(kuò)增用PCR 儀、基因芯片閱讀儀（深圳亞能生物技術(shù)有限公司）、金屬預(yù)洗脫儀、細(xì)胞超凈臺(tái)、離心機(jī)、ApoE 基因組DNA 檢測(cè)試劑盒（達(dá)安基因股份有限公司）。

1.3.2 基因組DNA 提取 采集受檢者清晨空腹外周靜脈血2 mL，乙二胺四乙酸二鉀（EDTA）抗凝，存于4 ℃冰箱，2 d 內(nèi)提取DNA。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書步驟提取人全基因組DNA。

1.3.3 PCR 擴(kuò)增 對(duì)所需基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增PCR 擴(kuò)增所需引物序列：F5，?AACAACT?GACCCCGGTGGCG?3，R5，?ATGGCGCTGAGGCC?GCGCTC?3；按照以下進(jìn)行操作PCR 擴(kuò)增：在50、95、94、65 ℃條件下分別維持2 min、15 min、30 s、45 s，并循環(huán)操作45 次；密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 基因組DNA 檢測(cè) 將在冰上保存的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取出10 μL，向其中加入60 μL 的直用型雜交液并混勻；去除ApoE 檢測(cè)芯片保護(hù)膜，將混合液加入檢測(cè)芯片對(duì)應(yīng)孔，混合液需覆蓋至檢測(cè)芯片表面；最后用芯片閱讀儀對(duì)檢測(cè)芯片判讀。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；將有無(wú)房性心律失常作為因變量，與房性心律失常發(fā)生有關(guān)的單因素作為協(xié)變量，采用二元lo?gistic 回歸進(jìn)行多因素分析；P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 房性心律失常組與對(duì)照組一般資料比較 兩組在性別、身高、體質(zhì)量、BMI、吸煙、2 型糖尿病病史方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在年齡、高血壓病病史、LAD、LVEF 方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 房性心律失常組與對(duì)照組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between atrial arrhythmia group and control group ±s

表1 房性心律失常組與對(duì)照組一般資料比較Tab.1 Comparison of general data between atrial arrhythmia group and control group ±s

注：BMI，體質(zhì)量指數(shù)；LAD，左心房?jī)?nèi)徑；LVEF，左心室射血分?jǐn)?shù)

一般資料性別（男∶女）年齡（歲）身高（cm）體重（kg）BMI（kg/m2）吸煙［例（%）］2 型糖尿?。劾?）］高血壓?。劾?）］LAD（mm）LVEF（mm）房性心律失常組（n=120）63∶57 74.57±8.12 164.99±8.05 67.05±12.52 24.33±3.52 33（27.5）8（6.7）34（28.3）42.87±11.10 53.80±9.26對(duì)照組（n=120）59∶61 65.67±12.46 163.77±9.34 70.41±10.13 26.13±3.57 30（25）6（5.0）16（13.38）35.56±4.54 58.35±9.52 t/χ2/F 值0.267 6.559 1.088-2.283-3.885 0.194 0.303 8.185 6.679-3.752 P 值0.605<0.001 0.278 0.123 0.509 0.669 0.581 0.004 0.001<0.001

2.2 ApoE 基因多態(tài)性分析 經(jīng)檢驗(yàn)兩組ApoE 的基因型均符合Hardy?Weinberg 遺傳平衡定律，說(shuō)明所收集的兩組資料都較為可靠，具有良好的群體代表性。房性心律失常組較對(duì)照組ε3/ε3 基因型明顯減少，ε3/ε4 和ε4/ε4 基因型明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組ApoE 基因多態(tài)性分布結(jié)果Tab.2 Distribution of ApoE gene polymorphism in two groups例

2.3 兩組ApoE 基因表型分布 房性心律失常組與對(duì)照組ApoE2 型分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組均以ApoE3 型為主，但房性心律失常組ApoE3 型表達(dá)較對(duì)照組明顯減少，ApoE4 型表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3）；房顫組和其他房性心律失常組基因表型分布對(duì)比，房顫組ApoE2 型比例明顯偏少，ApoE4 型比例明顯增多（P＜0.05，表4）。

表3 兩組ApoE 基因表型分布Tab.3 Phenotype of ApoE gene in two groups例

表4 房性心律失常組ApoE 基因表型分布Tab.4 Phenotype of ApoE gene in atrial arrhythmias groups例

2.4 房性心律失常發(fā)生相關(guān)因素的回歸分析 分析表明年齡、LAD、LVEF、ApoEε4 為房顫發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

表5 房性心律失常發(fā)生相關(guān)因素的多因素logistic 回歸分析Tab.5 Multivariate logistic regression analysis of related factors of atrial arrhythmia

3 討論

ApoE 基因編碼六種基因型，通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)機(jī)體脂質(zhì)代謝，具有組織修復(fù)、抑制血小板聚集和免疫調(diào)節(jié)等重要作用，與動(dòng)脈粥樣硬化、高脂蛋白血癥等多種疾病的發(fā)生有關(guān)［6］。

房性心律失常的發(fā)生很大程度上是由于炎癥因子浸潤(rùn)、心肌重構(gòu)、心肌纖維化等多種因素共同導(dǎo)致。

在心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)之前首先會(huì)出現(xiàn)電重構(gòu)［7］，心房電重構(gòu)的主要離子基礎(chǔ)是K+外流增多或Na+及Ca2+內(nèi)流減少。腫瘤壞死因子?α（TNF?α）等炎癥因子可增加心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度［8］，引起L?型鈣通道活性下調(diào)，使Ca2+內(nèi)流減少，和心房電重構(gòu)的離子基礎(chǔ)相吻合；同時(shí)超載的Ca2+能激活鈣激活蛋白，通過(guò)降解肌鈣蛋白等心肌收縮蛋白導(dǎo)致心房收縮功能減退［9］繼而引起心房間質(zhì)纖維化，導(dǎo)致心房?jī)?nèi)沖動(dòng)傳導(dǎo)異常，誘發(fā)心房電重構(gòu)，進(jìn)一步誘發(fā)房性心律失常。

ApoE 具有調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)分泌及抵抗氧化應(yīng)激的作用，但ApoEε4 等位基因促炎能力較強(qiáng)，并可激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF?κB），從而引起TNF?α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1（TGF?β1）、單核細(xì)胞趨化蛋白?1（MCP?1）、超敏C 反應(yīng)蛋白（hs?CRP）、白細(xì)胞介素1（IL?1）、白細(xì)胞介素6（IL?6）等炎癥介質(zhì)的表達(dá)［10］，進(jìn)而引起心肌電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)［11］，促使房性心律失常的發(fā)生。

ApoE 可引起TGF?β1 表達(dá)增多，TGF?β1 是一種重要的促心肌纖維化因子，在纖維化的心肌活檢中均可發(fā)現(xiàn)TGF?β1 浸潤(rùn)，并且隨血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作用的增強(qiáng)而升高［12］，這間接支持ApoE基因與房性心律失常的相關(guān)性。

房性心律失常特別是房顫時(shí)心率加快、內(nèi)皮細(xì)胞血管活性物質(zhì)異常分泌、血流對(duì)血管壁沖擊加劇繼而導(dǎo)致內(nèi)皮功能減退、受損，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化［12?13］。ApoE 基因異常表達(dá)時(shí)易導(dǎo)致內(nèi)皮損傷、脂質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)和過(guò)氧化從而進(jìn)一步造成動(dòng)脈粥樣硬化［14］。

綜合以上理論基礎(chǔ)，筆者認(rèn)為房性心律失常與ApoE 基因多態(tài)性表達(dá)有一定的關(guān)系。

本研究結(jié)果顯示，房性心律失常組與對(duì)照組在性別、身高、BMI、吸煙、2 型糖尿病等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表示一般人群不會(huì)因?yàn)樯鲜鲆蛩氐牟町惗黾臃啃孕穆墒С５陌l(fā)生率；在年齡、高血壓病、LAD、LVEF 方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示年齡越大、患高血壓病、左房?jī)?nèi)徑越大、射血分?jǐn)?shù)下降的人群房性心律失常的發(fā)生率可能更高。左房?jī)?nèi)徑大、左室射血分?jǐn)?shù)下降者大多伴有心肌電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、纖維化等，易導(dǎo)致房性心律失常。對(duì)于高血壓病患者來(lái)說(shuō)，血管壁持續(xù)性壓力增加，易發(fā)生內(nèi)皮細(xì)胞損傷，內(nèi)皮素釋放增多，進(jìn)一步導(dǎo)致C 反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素（IL）等炎癥介質(zhì)的浸潤(rùn)［15］，繼而出現(xiàn)心房電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)、左房擴(kuò)大［16］，有了房性心律失常發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。

本研究檢出ApoE 6 種基因型，無(wú)論是房性心律失常組還是對(duì)照組均以ε3/ε3 頻率最高，占總數(shù)一半以上，這與以往文獻(xiàn)研究中ApoE 基因型人群分布大體一致［17］。本研究中房性心律失常組較對(duì)照組ε3/ε3 基因型明顯減少，風(fēng)險(xiǎn)類基因型明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可能與ε4 等位基因具有較強(qiáng)的促炎作用，通過(guò)炎癥途徑參與房性心律失常的發(fā)生有關(guān)。同樣支持ApoE4 型可能發(fā)生房性心律失常的風(fēng)險(xiǎn)高。

進(jìn)一步對(duì)心律失常亞組分析發(fā)現(xiàn)，房顫組較其他房性心律失常組ApoE4 型明顯增多，ApoE2 型比例減少，這與張秀玲等［18］研究結(jié)果相似，這可能與房顫炎癥、內(nèi)皮損傷程度高于其他房性心律失常有關(guān)。與ε4 等位基因相反，ε2 等位基因具有抗炎作用，可能降低房顫發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。心律失常兩亞組間ApoE2 型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但房性心律失常和對(duì)照組之間ApoE2 型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義，所以ApoE2 能否作為降低所有房性心律失常發(fā)生的有利因素，需要進(jìn)一步的大樣本研究論證。

根據(jù)房性心律失常發(fā)生相關(guān)因素的回歸分析結(jié)果進(jìn)一步證明，ApoE 基因多態(tài)性為房性心律失常發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，ApoE4 型是房性心律失常發(fā)生的危險(xiǎn)因素。但是在回歸分析中發(fā)現(xiàn)高血壓并不是房性心律失常發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素，和前面的基礎(chǔ)資料以及相關(guān)研究不一致，可能與病例數(shù)偏少或高血壓與其他導(dǎo)致房性心律失常的某些原因具有相關(guān)性造成統(tǒng)計(jì)學(xué)干擾。

綜上所述，雖然目前ApoE 基因多態(tài)性與房性心律失常的相關(guān)機(jī)制尚未完全明確，但根據(jù)文獻(xiàn)及本研究結(jié)果，房性心律失常一定程度上受ApoE基因多態(tài)性的影響，ApoE4 型是導(dǎo)致房性心律失常發(fā)生的主要危險(xiǎn)表型；ApoE4 型更容易發(fā)生房顫或其他房性心律失常；ApoE 基因多態(tài)性和房性心律失常存在密切的聯(lián)系，其中以房顫相關(guān)性最為明顯。另外在關(guān)聯(lián)因素回歸分析中同樣證明年齡越大、左房?jī)?nèi)徑越大、射血分?jǐn)?shù)下降的人群房性心律失常的發(fā)生率更高。為預(yù)防心血管事件，應(yīng)重視從基因分子水平干預(yù)房性心律失常，從而減少房性心律失常的發(fā)生及其所導(dǎo)致的各種嚴(yán)重并發(fā)癥。

本研究的不足之處在于所收集的樣本量較局限，沒(méi)有進(jìn)行大范圍、多地區(qū)的抽樣檢測(cè)，所有血標(biāo)本保存、運(yùn)輸及檢測(cè)過(guò)程未能全程監(jiān)測(cè)，可能會(huì)造成非人為方面的誤差。在今后的臨床研究中將逐漸擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探討ApoE2 在房性心律失常中的作用，完善細(xì)化多地區(qū)人群研究及患者長(zhǎng)期復(fù)查及隨訪資料。