不同濃度的完全弗氏佐劑影響大鼠疼痛行為的觀察

賈欣 代潔瓊 喬巧玉 趙欣 王志華 關(guān)曉雅 杜振瑩 張宇

【摘要】 目的：觀察腳掌注射不同濃度完全弗氏佐劑（complete Freunds adjuvant，CFA）產(chǎn)生的不同強度的傷害刺激對大鼠痛感受和痛情緒反應(yīng)程度的影響。方法：福爾馬林誘導(dǎo)的條件性位置回避（conditioned place avoidance，CPA）的行為測試近來被用于評估痛情緒反應(yīng)。本實驗采用另一種炎性致痛物質(zhì)CFA在大鼠的腳掌皮下注射使之產(chǎn)生持續(xù)性炎性痛，誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生條件性位置回避（conditioned place avoidance，C-CPA）反應(yīng)。根據(jù)在大鼠的腳掌皮下注射不同濃度的CFA將大鼠分為正常（Naive）組，生理鹽水（NS）組，1/5 CFA組，1/3 CFA組，1/2 CFA組，之后分別檢測各組大鼠的熱縮足潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）和C-CPA反應(yīng)。結(jié)果：1/3 CFA組和1/2 CFA組匹配后熱縮足潛伏期與匹配前比較，均明顯減小，即痛閾下降，且兩組匹配前與匹配后的差值與生理鹽水組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；1/3 CFA組的下降值小于1/2 CFA組（P<0.05）；1/2 CFA組在匹配后痛側(cè)停留的時間明顯縮短，且回避分數(shù)與生理鹽水組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結(jié)論：CFA所誘導(dǎo)的PWL反應(yīng)和CPA反應(yīng)的程度與CFA的注射濃度有關(guān)，從行為上證實大鼠痛情緒與痛感受的產(chǎn)生存在不同的機制。

【關(guān)鍵詞】 完全弗氏佐劑； 條件性位置回避； 前扣帶皮層； 痛情緒

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.29.001

慢性疼痛是一個世界性的醫(yī)療難題，它既是與大多數(shù)疾病相伴生的臨床癥狀，同時本身也是一種疾病[1]?；颊叱嗽馐芴弁丛斐傻娜怏w傷害之外，其導(dǎo)致的心理、精神傷害和社會并發(fā)癥也成了一個重大的負擔[2-3]。國際疼痛協(xié)會對疼痛的最新定義為“疼痛是一種與組織損傷或潛在的組織損傷相關(guān)的感覺、情感、認知和社會維度的痛苦體驗”[4]。這一定義將疼痛分為感覺、情感、認知和社會四個維度，其中痛感覺主要感受疼痛刺激的性質(zhì)、位置、強度等，痛情緒則指傷害性刺激引起的焦慮、恐懼、厭惡等情緒反應(yīng)[5]。痛情緒可分兩個階段：一是痛不愉快感（feeling of unpleasantness），它是對痛刺激的即時反應(yīng)，又稱原發(fā)性不愉快（primary unpleasantness）；二是繼發(fā)性不愉快（secondary unpleasantness），是一種疼痛長期作用引起的情緒反應(yīng)，它和接受疼痛刺激時所處的環(huán)境、疼痛對將來生活的影響、慢性疼痛引發(fā)的焦慮恐懼等密切相關(guān)，其涉及疼痛、認知、學習記憶等因素，需要大腦的高級中樞對這些信息進行整合[6]。與痛感受相比，介導(dǎo)痛情緒的神經(jīng)傳導(dǎo)通路及其產(chǎn)生的中樞機制大為不同。

研究表明軀體感覺皮質(zhì)（S1和S2）和島葉皮層被認為是編碼痛感覺，包括性質(zhì)（刺痛、灼熱痛或心絞痛）、定位和強度[7-9]。前額區(qū)域和邊緣系統(tǒng)（ACC、PFC、杏仁核、VTA和伏隔核）編碼情緒和動機反應(yīng)，并且和痛的情感和聯(lián)系方面是有關(guān)聯(lián)的[7，10-12]。和臨床研究相反，在動物實驗中很難去評價痛情緒。最近，各種各樣的方法已經(jīng)被應(yīng)用評價持續(xù)性疼痛，在這些方法中，條件性位置回避（CPA）能夠去評價大鼠的痛情緒[13]。在此基礎(chǔ)上筆者實驗室通過使用自制的CPA裝置來檢測大鼠的痛情緒，使用不同濃度的完全弗氏佐劑（CFA）作為炎性致痛物質(zhì)來誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生慢痛反應(yīng)，以此來觀察腳掌注射不同濃度CFA產(chǎn)生的不同強度的傷害刺激對大鼠痛感受和痛情緒反應(yīng)程度的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.1.1 實驗動物與分組 體重250～270 g的成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，購于北京海淀興旺實驗動物養(yǎng)殖場。大鼠分籠飼養(yǎng)于動物房，每籠4只，動物房室溫維持在（22±1）℃，相對濕度40%～60%，大鼠能夠自由進食、進水，晝夜循環(huán)光照，各12 h，大鼠領(lǐng)養(yǎng)回來適應(yīng)1周后進行實驗。根據(jù)大鼠左側(cè)后腳掌注射不同濃度的CFA/NS，將大鼠分為5組：正常（Naive）組（7只），生理鹽水（NS）組（6只），1/5 CFA組（6只），1/3 CFA組（7只），1/2 CFA組（7只）。

1.1.2 實驗儀器與試劑 熱板刺激儀（life science），條件性位置回避裝置（自制），完全弗氏佐劑（CFA，sigma），嚙齒類動物固定裝置，NeuroMotive軟件（USA），ANY-maze軟件（USA）。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立大鼠持續(xù)性疼痛模型 配制不同濃度的CFA：CFA原液與0.9%氯化鈉注射液分別按照0.25︰1、0.5︰1、1︰1的體積比混合成乳化狀態(tài)。將大鼠固定于嚙齒類動物固定裝置上，抽取上述配好的混合液0.08 mL皮下注射于大鼠的左側(cè)后腳掌。同時左側(cè)后腳掌注射0.08 mL的0.9%氯化鈉注射液作為對照。

1.2.2 痛行為和痛情緒的檢測 （1）檢測大鼠對熱痛刺激的腳掌回縮潛伏期（PWL）。使用熱板刺激儀進行測定，根據(jù)實驗?zāi)康脑谀_掌注射CFA的前1 d和第2天條件性位置回避（CPA）行為測完后進行。先將大鼠放入熱板刺激儀的有機玻璃罩內(nèi)適應(yīng)30 min，后取出，將熱板升溫至50 ℃，再次將大鼠放入有機玻璃罩內(nèi)，從大鼠腳掌接觸熱板開始計時，大鼠出現(xiàn)舔后足或抬起即縮足反應(yīng)時計時停止，此時間即為大鼠腳掌回縮潛伏期（paw withdraw latency，PWL）。每只大鼠測量3次，中間間隔15～20 min，之后取3次的平均值。（2）CPA反應(yīng)的檢測。通過條件性位置回避實驗來反映大鼠的痛情緒反應(yīng)。條件性位置回避的建立與檢測：①自制條件性位置回避裝置[14-15]，在進行條件性位置回避誘導(dǎo)時，隨機設(shè)置其中一側(cè)為非CFA匹配室即非痛環(huán)境，而另一側(cè)則與致痛劑CFA注射進行耦合，稱之為CFA匹配室，即痛環(huán)境。②CPA的檢測：分三天進行，第一天，稱重：選取符合體重的SD雄性大鼠（250～270 g），測CPA的基礎(chǔ)值（baseline）：暗室適應(yīng)30 min，后放入CPA裝置自由活動

10 min，用軟件分析大鼠在兩側(cè)的停留時間。第二天：暗室適應(yīng)30 min，后與非痛環(huán)境耦合30 min，左側(cè)后腳掌皮下注射不同濃度的CFA/NS；CFA注射后休息120 min，之后置于暗室適應(yīng)30 min，再進行痛環(huán)境耦合30 min。第三天：同第一天，暗室適應(yīng)30 min，后放入CPA裝置自由活動10 min，用軟件分析大鼠在痛環(huán)境和非痛環(huán)境的停留時間。第三天痛側(cè)停留的時間減去第一天痛側(cè)停留時間即為回避分數(shù)，值越大代表回避程度越大，大鼠產(chǎn)生的痛情緒越明顯。該方法的流程圖見圖1。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對t檢驗，兩組間比較采用t檢驗，符合正態(tài)分布的采用單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的采用非參數(shù)檢驗，用GraphPad Prism 5.0軟件繪制統(tǒng)計圖。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 注射不同濃度的CFA后大鼠的熱痛反應(yīng)比較 Naive組、NS組和1/5CF A組第一天和第三天的腳掌回縮潛伏期比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），1/3 CFA組和1/2 CFA組第一天與第三天的腳掌回縮潛伏期比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且第三天均顯著減小，即熱痛閾降低。1/3 CFA組和1/2 CFA組匹配前與匹配后的差值與NS組比較，差異均有統(tǒng)計學（P<0.05），且1/3 CFA組下降值明顯小于1/2 CFA組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2、表1。

2.2 注射不同濃度的CFA后大鼠的CPA反應(yīng) 大鼠左側(cè)腳掌注射不同濃度的CFA使得大鼠在痛環(huán)境匹配前后痛側(cè)環(huán)境的停留時間發(fā)生變化，Naive組、NS組、1/5 CFA組和1/3 CFA組匹配前在痛側(cè)環(huán)境的停留時間和匹配后的停留時間比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），1/2 CFA組匹配前在痛側(cè)環(huán)境的停留時間和匹配后的停留時間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且匹配后在痛側(cè)停留的時間明顯縮短。1/2 CFA組的回避分數(shù)與NS組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），Naive組、NS組、1/5 CFA組和1/3 CFA組的回避分數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2、圖3。

3 討論

慢性持續(xù)性疼痛作為一種對經(jīng)濟、社會產(chǎn)生重大影響的疾病，一直備受關(guān)注。長久以來慢性疼痛給患者帶來的不僅是難以忍受的疼痛感受，而且還會產(chǎn)生更為嚴重的影響人們身心健康的負性情緒[16]。Harkines等[17]采用Eysenek and Eysenek問卷法對105個肌筋膜疼痛功能障礙（MPD）患者進行研究，分別觀察兩種相反的性格對痛感覺、痛情緒的影響，結(jié)果顯示痛感覺和痛情緒可能存在分離、并行和序次的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通路。上行傳導(dǎo)束有兩大系統(tǒng)其一是由腦干內(nèi)測區(qū)上行的，經(jīng)過舊脊丘束、脊髓中腦束、脊髓臂旁-杏仁束、脊髓臂旁-下丘腦束和脊髓下丘腦束，它們主要傳遞痛情感信息；另一個是位于腦干外側(cè)區(qū)的，經(jīng)過新脊丘束、脊頸束和脊髓背側(cè)柱，主要傳遞痛的感覺分辨信息[18]。人們對痛感覺的研究在多個方面都取得了進展，但對痛情緒的研究卻相對較慢。痛感覺誘發(fā)痛情緒有著比較明確的解剖結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和共同的物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。在此基礎(chǔ)上筆者所在實驗室通過使用自制的CPA裝置來檢測大鼠的痛情緒，由于CPA能檢測到與痛直接相關(guān)的情緒改變，并且沒有進一步的傷害性刺激，因此越來越多的研究者認同這一行為學實驗方案[15]。實驗室前期證實了CFA與NS按照體積比為1︰1混合，皮下注射入大鼠左側(cè)后腳掌后，可以誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生CPA反應(yīng)，即使大鼠對痛環(huán)境產(chǎn)生厭惡，也使得大鼠的痛行為發(fā)生改變。因此本實驗主要探討腳掌注射不同濃度CFA產(chǎn)生的不同強度的傷害刺激對大鼠痛感受和痛情緒反應(yīng)程度的影響。

在實驗中，實驗者通過給大鼠的左側(cè)后腳掌注射不同濃度的CFA，檢測大鼠的熱縮足潛伏期及CPA反應(yīng)。痛感覺檢測的結(jié)果顯示，1/3 CFA組、1/2 CFA組與其他組相比，熱痛閾都明顯下降，1/2 CFA組的下降值更明顯，說明這兩個濃度的CFA可以使大鼠對熱刺激的敏感性增加；痛情緒結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度組即1/2 CFA組與其他組相比，產(chǎn)生了CPA反應(yīng)，即引起了大鼠的痛情緒反應(yīng)。1/3 CFA組雖然產(chǎn)生了痛感覺，但其強度不足以引起痛情緒，但更高濃度CFA的作用能同時誘導(dǎo)痛感受和痛情緒的發(fā)生。說明痛感受的程度與傷害性刺激的程度相關(guān)，痛情緒的強弱也與傷害性刺激的程度有關(guān)，而同樣的傷害性刺激，痛感受和痛情緒產(chǎn)生的閾值是不同的。這也從另一個角度說明，痛感受和痛情緒反應(yīng)雖然都來源于同樣的傷害性刺激，但它們卻是通過不同的傳導(dǎo)途徑和機制產(chǎn)生的。

致謝：本實驗在山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學系完成，感謝各位老師和同學們在實驗中對我的幫助。

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（收稿日期：2018-05-07） （本文編輯：張爽）