加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠血清PCT CRP和免疫功能的影響

蔣朱秀 李敏靜 陳曄 江勁 殷舟 鄭小偉

膿毒癥是重癥病房的最常見(jiàn)危重癥之一，多繼發(fā)于嚴(yán)重感染、休克、創(chuàng)傷和大手術(shù)后，是由于局部或全身感染等因素所導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合癥（SIRS），是誘發(fā)多臟器功能障礙綜合癥（MODS）的重要原因，也是臨床上危重病中最常見(jiàn)的死亡原因［1］。肺臟是這一連貫的病理過(guò)程中最易受損傷的首位靶器官［2］，因此膿毒癥并發(fā)急性肺損傷是膿毒癥患者死亡最常見(jiàn)的病因，急性肺損傷（ALI）是各種原因造成急性彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，而導(dǎo)致的急性低氧性呼吸衰竭。中西醫(yī)結(jié)合治療在臨床中運(yùn)用廣泛，但其機(jī)制尚不明確，本研究通過(guò)加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠的血清降鈣素原（PCT）、C反應(yīng)蛋白（CRP）和免疫功能的影響進(jìn)行探討，從而闡明加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷的炎癥抑制和免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為200～220g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-2016，動(dòng)物合格證號(hào)：2008001665123，購(gòu)于上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房。

1.2 主要試劑 PCT試劑盒： 德國(guó)羅氏公司化學(xué)發(fā)光法試劑盒，批號(hào)：23285903；CRP試劑盒：日本SEKISUIMEDICAL公司，批號(hào)：908RAO；T細(xì)胞亞群試劑盒：美國(guó)BD公司，批號(hào)90719。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 加味大承氣湯由大黃、芒硝各10g，厚樸、枳實(shí)、麥冬、當(dāng)歸各12g，生黃芪20g組成。藥物均購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥房，自動(dòng)煎藥機(jī)煎出藥液，再濃縮為含生藥10g/ml。醋酸地塞米松片：浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)1505121。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 （1）膿毒癥急性肺損傷模型的制備：實(shí)驗(yàn)大鼠購(gòu)來(lái)后清潔級(jí)飼養(yǎng)7d，實(shí)驗(yàn)前自由飲水，禁食過(guò)夜。預(yù)留正常對(duì)照大鼠組后，其余大鼠均進(jìn)行造模處理，以5%氯胺酮（0.2ml/100g體重）肌肉麻醉后，將動(dòng)物固定、腹部脫毛、消毒、鋪無(wú)菌洞巾。沿腹正中線作1.5cm切口，找到盲腸，仔細(xì)剝離腸系膜，在盲腸根部結(jié)扎盲腸，避免結(jié)扎回腸及盲腸系膜血管。用5ml塑料注射器針頭穿刺盲腸3次，擠出少許腸內(nèi)容物。之后，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁切口，術(shù)畢。立即予實(shí)驗(yàn)大鼠皮下注射生理鹽水10ml進(jìn)行抗休克處理。（2）動(dòng)物分組和給藥：大鼠無(wú)干預(yù)飼養(yǎng)后隨機(jī)分為正常對(duì)照組、急性肺損傷模型組、加味大承氣湯（中藥組）、地塞米松組、中藥+地塞米松（中西醫(yī)結(jié)合組），每組各8只。造模后立即灌胃給藥1次，以及造模后8h再灌胃1次，各組給藥治療方案：中藥組分別以10ml/kg的劑量灌胃2次；地塞米松組分別以5mg/kg的劑量灌胃2次；中西醫(yī)結(jié)合組兩種藥物同時(shí)灌胃，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均以劑量10ml/kg的生理鹽水灌胃。各組大鼠于造模后24h處死收集標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 標(biāo)本采集與處理 血清PCT、CRP和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者血液中CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)的檢測(cè)：各組大鼠麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，離心，取上清液，-20℃貯存?zhèn)溆茫捎玫聡?guó)羅氏公司化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清PCT水平，血清PCT正常參考范圍為0～0.05ng/ml，PCT＞0.05ng/ml為陽(yáng)性。采用貝克曼生化分析儀檢測(cè)CRP，以CRP≥10mg/L為陽(yáng)性。采用全血直標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群，分析CD4+、CD8+細(xì)胞百分率，并計(jì)算 CD4+/CD8+值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有非常顯著性。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)觀察 正常組大鼠飲食毛發(fā)均正常，呼吸均勻平穩(wěn)，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠部分死亡，皮毛無(wú)光澤，精神萎靡，呼吸急促，口鼻周圍可見(jiàn)分泌物，攝食能力差；藥物干預(yù)治療組大鼠死亡率低，大鼠的活動(dòng)反應(yīng)性以及進(jìn)食飲水狀況明顯改善，其中以中西結(jié)合治療組大鼠存活情況最佳，其呼吸、進(jìn)食、活動(dòng)情況和反應(yīng)性均恢復(fù)到最佳。

2.2 各組大鼠腹腔和肺臟肉眼形態(tài)學(xué)觀察 正常組大鼠腹腔中無(wú)明顯滲液，各臟器供血良好，肺臟外觀色澤粉紅，無(wú)明顯異常；模型組大鼠腹腔中可見(jiàn)大量混濁滲液，胃腸組織脹氣充血，肺組織充血水腫脹大，呈暗紅色。而中藥組、地塞米松組和中西醫(yī)結(jié)合組則腹腔滲液和肺組織水腫明顯輕于模型組。

2.3 加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠血清PCT和CRP的影響 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清PCT和CRP的變化（x±s）

2.4 加味大承氣湯對(duì)膿毒癥急性肺損傷大鼠免疫功能的影響 見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠CD4+、CD8+CD4+/CD8+的變化（x±s）

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肺主一身之氣，肺與大腸相表里，肺臟是膿毒癥最早發(fā)生衰竭的器官，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)也通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)說(shuō)、黏膜免疫學(xué)說(shuō)等研究表明，腸源性內(nèi)毒素可通過(guò)血流、淋巴等途徑進(jìn)入肺臟和毛細(xì)血管，刺激巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等分泌大量的炎癥因子，引起肺內(nèi)過(guò)度性、瀑布樣炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致急性肺損傷而致呼吸衰竭死亡［3］。

PCT是膿毒癥血清中發(fā)現(xiàn)的一種新型感染學(xué)生物標(biāo)記物，尤其是對(duì)細(xì)菌感染的膿毒癥早期診斷有較高的特異性和敏感性，并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。它是無(wú)激素活性的降鈣素前體，可由炎癥因子和細(xì)菌毒素誘導(dǎo)產(chǎn)生，當(dāng)膿毒癥發(fā)生時(shí)，血清PCT可迅速升高。而CRP是傳統(tǒng)的判斷感染程度的指標(biāo)，一般情況下，健康人血液中CRP濃度較低，當(dāng)發(fā)生細(xì)菌感染等病理情況時(shí)CRP則被大量釋放入血液，而感染控制后逐漸下降［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組治療前PCT、CRP的含量均較高，采用藥物干預(yù)治療后均有不同程度的降低，其中以加味大承氣湯聯(lián)合地塞米松組治療效果最佳，該結(jié)果表明加味大承氣湯可以有效的抑制或阻斷膿毒癥合并急性肺損傷患者的過(guò)度炎癥反應(yīng)，對(duì)PCT和CRP具有一定的清除作用。

T淋巴細(xì)胞亞群的分布和數(shù)量在一定程度上反應(yīng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能狀態(tài)，所有T淋巴細(xì)胞表面的共同標(biāo)記物CD3+代表體內(nèi) T淋巴細(xì)胞總數(shù)；Ti/Th的表面標(biāo)記物是CD4+，能夠誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞等功能；CD8+則代表抑制性T細(xì)胞，具有介導(dǎo)對(duì)病原體感染的自身細(xì)胞殺傷和溶解作用。在哺乳類動(dòng)物中CD4+/ CD8+的比值一般為2，可大致反映出機(jī)體免疫內(nèi)環(huán)境是否穩(wěn)定，若比值偏離正常值，說(shuō)明機(jī)體免疫功能遭到破壞失調(diào)［5-6］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠與正常組大鼠相比，CD4+/ CD8+比值偏離明顯，采用三種方法進(jìn)行干預(yù)治療后，CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比均有不同的增加，其中以中西醫(yī)結(jié)合組增加的程度要明顯高于單獨(dú)治療組，說(shuō)明誘導(dǎo)/輔助性T細(xì)胞數(shù)量增多，反映使用加味大承氣湯聯(lián)合治療后能夠進(jìn)一步加強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。

膿毒癥合并急性肺損傷是臨床常見(jiàn)危重疾病，隨著感染的發(fā)生加重，胃腸道黏膜屏障受損，菌群紊亂，內(nèi)毒素入血，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。本研究采用肺腸同治的方法，加味大承氣湯具有清熱解毒、活血、補(bǔ)氣等功效，現(xiàn)代研究證實(shí)，方中大黃可有效抑制腸道細(xì)菌繁殖，防止腸道細(xì)菌移位及內(nèi)毒素吸收，促進(jìn)腸蠕動(dòng)和保護(hù)胃腸黏膜屏障，改善腸麻痹［7-8］，黃芪、當(dāng)歸、麥冬等也具有胃腸黏膜保護(hù)，增強(qiáng)心肌收縮力，抗炎、調(diào)節(jié)免疫功能和抗內(nèi)毒素活性作用。方中大黃、芒硝瀉熱通便，厚樸、枳實(shí)理氣通腹，黃芪、當(dāng)歸補(bǔ)氣養(yǎng)血活血，麥冬養(yǎng)陰生津。全方使正氣得復(fù)，陰液滋生，腑氣得通。本研究結(jié)果表明加味大承氣湯能降低PCT和C反應(yīng)蛋白水平，在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)，提高機(jī)體免疫功能，其中以加味大承氣湯聯(lián)合地塞米松組效果最佳，可以有效治療膿毒癥急性肺損傷，值得后期在臨床使用中推廣。