水稻葉色突變研究進(jìn)展

趙紹路，劉 凱，宛柏杰，朱靜雯，劉艷艷，唐紅生，嚴(yán)國紅，孫明法

（江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城224000）

水稻是我國主要的糧食作物，也是基因功能研究的模式植物。提高水稻葉片中的葉綠素含量，可以增加水稻的生物產(chǎn)量，因而具有超高產(chǎn)潛力的水稻品種往往表現(xiàn)為植株光合作用能力強(qiáng)，后期不早衰，抗逆性也顯著高于一般品種。水稻收獲籽粒中80%以上的干物質(zhì)是開花以后通過光合作用獲得的[1]，因此對(duì)水稻葉色突變體的研究將有助于探索植物光合作用、光形態(tài)建成、葉綠素生物合成與降解途徑的分子機(jī)制等生理過程。目前水稻葉色突變體已直接應(yīng)用于雜交水稻制種和F1種子純度鑒定中，具有廣闊的市場(chǎng)前景。因此通過不斷挖掘新的水稻葉色變異材料，闡述水稻葉色突變基因的分子遺傳機(jī)制，將具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

1 水稻葉色突變的概念

水稻葉色突變是自然界中比較常見的一種突變性狀，一般是指葉片中葉綠素的合成或降解受到不可避免的影響，從而造成葉綠素含量的改變，表現(xiàn)出不正常的綠色。前期研究者認(rèn)為葉色突變可能會(huì)影響植株的光合作用，抑制水稻的正常生長，進(jìn)而造成農(nóng)作物減產(chǎn)。葉色突變材料是研究植物光合效率、葉綠體產(chǎn)生、葉綠體結(jié)構(gòu)、葉綠素合成和代謝途徑及其分子遺傳機(jī)制的理想對(duì)象[2]。到目前為止，在其他植物中，如擬南芥[3]、菊花[4]、羊茅[5]等多種植物中均有葉色變異材料的報(bào)道。

2 水稻葉色突變體的分類

水稻葉色突變體除了少量的自然突變以外，絕大部分是研究者通過物理誘變、化學(xué)誘變、射線輻射以及T-DNA插入等方式誘發(fā)獲得的突變，因此水稻葉色突變體的變異類型十分豐富，一般根據(jù)苗期不同的葉色表現(xiàn)可將其劃分為轉(zhuǎn)綠型、白化、黃化、條紋、斑馬紋以及黃色斑點(diǎn)共6種類型[6]。也有一些突變體在營養(yǎng)生長期并不表現(xiàn)出葉色變異，到了生殖生長期才有所表現(xiàn)，如水稻滯綠突變體[7]。此外，水稻葉色突變受環(huán)境因素的影響較大，例如溫度、光照時(shí)間及光照度等，因而劉艷霞等將水稻葉色突變體劃分為高溫敏感型、低溫敏感型和特殊溫敏感型[8]。此外，Kusumi等根據(jù)葉色對(duì)光照的響應(yīng)，將其劃分為光誘導(dǎo)依賴和非依賴2種類型[9]。

3 水稻葉色突變相關(guān)基因分子遺傳研究

水稻葉色突變體是一類較常見的變異表型，且變異類型較多。迄今為止，國內(nèi)外對(duì)有關(guān)水稻葉色突變體的研究很多，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，在Gramene（http://www.gramene.org/）網(wǎng)站上已公布的與水稻葉綠素含量相關(guān)基因超過140個(gè)，它們廣泛分布在第1～第12號(hào)染色體上，目前已克隆水稻葉色相關(guān)基因37個(gè)，但尚未從第12號(hào)染色體上克隆出來（表1）。這些葉色基因的定位和克隆為深入闡釋葉綠體功能和代謝途徑的機(jī)制分析奠定基礎(chǔ)。根據(jù)這些基因在葉綠體內(nèi)的功能，可將其分為以下幾類：葉綠素合成與代謝途徑相關(guān)基因、葉綠體發(fā)育途徑相關(guān)基因、質(zhì)-核信號(hào)傳導(dǎo)途徑受阻相關(guān)基因等，下面作重點(diǎn)闡述。

表1 已克隆水稻葉色相關(guān)基因

3.1 葉綠素合成與代謝途徑相關(guān)基因研究

葉綠素（chlorophyll,Chl）的生物合成是一個(gè)由多個(gè)基因和酶調(diào)控參與的生化過程，它起始于谷氨酸-tRNA，最終生成葉綠素a和葉綠素b[40]。葉綠素合成途徑中任何一個(gè)基因和酶促反應(yīng)發(fā)生變化，都會(huì)造成葉綠素合成受阻，引起葉色突變。OsSGR是Jiang等通過γ射線輻射水稻品種日本晴發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與水稻葉綠素降解途徑相關(guān)的基因，該基因被定位于水稻第9染色體，編碼一個(gè)高度保守的蛋白，是具有水溶性的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，亞細(xì)胞定位于類囊體膜上，在轉(zhuǎn)錄水平影響葉綠素的降解[7]。Cha等研究表明，OsSGR的功能與葉綠素降解調(diào)控有關(guān)，通過激發(fā)多個(gè)葉綠素降解酶（例如NYC、PPH、RCCR、PAO等）直接與LHCPⅡ（light-harvesting complexⅡ）結(jié)合，在類囊體膜上形成復(fù)合物，誘導(dǎo)LHCPⅡ降解，促使葉綠素的降解[41]。

Morita等利用電離輻射獲得了NYC3突變體，圖位克隆發(fā)現(xiàn)該基因位于水稻第6染色體著絲粒附近，編碼1個(gè)α/β折疊水解酶家族蛋白，可能是1個(gè)葉綠素酶，但沒有葉綠素酶的活性。NYC3在正常衰老葉片中的表達(dá)量很低，而在暗誘導(dǎo)后葉片中的表達(dá)量很高，在其他非光合組織中，如根部也有少量表達(dá)。NYC3突變體在黑暗誘導(dǎo)衰老葉片中葉綠素a和葉綠素b的含量比野生型高，其他參數(shù)如Fv/Fm和細(xì)胞膜離子滲漏等指標(biāo)都下降，說明NYC3是1個(gè)非功能型持綠突變體[28]。

Yamatani等利用碳粒子束獲得了另一個(gè)水稻持綠突變體NCY4，圖位克隆將該基因定位于第7染色體，為擬南芥THF1的同源基因[32]，而THF1編碼1個(gè)多功能蛋白，參與植物體內(nèi)糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病機(jī)制和高光馴化等過程[42-43]。NCY4編碼1個(gè)類囊體形成蛋白THF1，主要控制葉綠體中內(nèi)囊體的形成，在葉綠素降解過程中起重要作用。對(duì)突變體進(jìn)行暗處理后受衰老誘導(dǎo)且與葉綠素降解相關(guān)的基因，如OsSGR、NYC3、NYC1、NOL、OsRCCR1、OsPAO以及其他衰老誘導(dǎo)基因Osh36都得到上調(diào)表達(dá)，表明NCY4體內(nèi)的衰老進(jìn)程并未受阻，NCY4是1個(gè)非功能型突變體。然而與其他持綠突變體如NYC1、OsSGR、NOL和NYC3不同的是，在衰老的過程中NCY4的葉綠素?zé)晒鈪?shù)如Fv/Fm與野生型相比，維持在較高水平，且PSⅡ亞基的穩(wěn)定性也比其他非功能型突變體的高。因而在今后的研究中要重點(diǎn)關(guān)注功能性的持綠突變體。

3.2 葉綠體發(fā)育途徑中相關(guān)基因研究

水稻葉綠體是由細(xì)胞前質(zhì)體分化發(fā)育而來，與水稻葉片的發(fā)育緊密相關(guān)。葉綠體的分化發(fā)育如果受到影響，將會(huì)導(dǎo)致葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)的缺陷、葉片中葉綠素含量以及其他光合色素比例的變化，因此葉綠體的發(fā)育也是一個(gè)十分復(fù)雜的過程。吳殿星等通過掃描電鏡觀察水稻不同葉色變異材料的葉綠體結(jié)構(gòu)后，突變體的表型雖不一樣，但是在突變植株的突變區(qū)域里葉綠體的發(fā)育均出現(xiàn)異常，發(fā)育明顯遲緩[44]。例如溫度對(duì)葉綠體發(fā)育產(chǎn)生影響，Suginoto等通過圖位克隆的方法定位了一個(gè)溫度敏感型葉色突變體V2，它編碼一個(gè)位于線粒體上的鳥苷酸激酶，是影響水稻葉綠體發(fā)育途徑過程中的關(guān)鍵因子，發(fā)生突變后該基因會(huì)導(dǎo)致水稻葉片出現(xiàn)白化表型[45]。Bang等克隆了ObgC基因，它編碼SpoB相關(guān)的三磷酸鳥苷結(jié)合蛋白，對(duì)于葉綠體的發(fā)育非常重要，同時(shí)對(duì)水稻核糖體的生物合成也起到關(guān)鍵作用。ObgC基因敲除后，會(huì)導(dǎo)致植株中葉綠體發(fā)育延遲，葉片出現(xiàn)黃萎表型[34]。

3.3 核-質(zhì)信號(hào)途徑受阻相關(guān)基因研究

水稻核-質(zhì)信號(hào)途徑上的任何一個(gè)基因發(fā)生突變后，水稻葉綠體的發(fā)育就會(huì)受阻，并最終導(dǎo)致葉色出現(xiàn)變異。Xu等在水稻中克隆了PAPST1基因，該基因編碼一個(gè)3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)突變體植株的類囊體發(fā)育存在缺陷，因此在水稻葉片發(fā)育早期就表現(xiàn)枯黃。亞細(xì)胞定位研究表明OsPAPST1基因位于水稻線粒體外膜和葉綠體外膜上，推測(cè)其可能作為3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸載體，在細(xì)胞核和葉綠體之間起到信號(hào)傳導(dǎo)作用[11]。

一般研究認(rèn)為，水稻核基因組與細(xì)胞質(zhì)基因組之間存在相互關(guān)聯(lián)，這種作用稱之為核質(zhì)互作。一方面，細(xì)胞核基因控制著質(zhì)體的發(fā)育過程，如水稻核基因OsDVR發(fā)生突變后，致使葉綠體發(fā)育受到抑制，突變體就會(huì)表現(xiàn)出黃綠葉，導(dǎo)致植株生長進(jìn)程緩慢[16]。另一方面，葉綠體發(fā)育受阻或損傷會(huì)通過信號(hào)反饋途徑調(diào)控核基因的表達(dá)。在水稻葉綠體中，10%～15%蛋白由核基因編碼，其余部分的蛋白由細(xì)胞核和葉綠體共同編碼，兩者之間的相互作用對(duì)于葉綠體行使正常功能是必需的。此外，在水稻中葉綠體的發(fā)育需要多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的輔助和參與，例如光敏色素互作因子和GLK2蛋白。水稻中定位于細(xì)胞核的Cga1就編碼一個(gè)細(xì)胞分裂素應(yīng)答的GATA轉(zhuǎn)錄因子，過表達(dá)該基因會(huì)導(dǎo)致水稻葉片變深綠、分蘗數(shù)減少，相反地，RNAi沉默Cga1則會(huì)造成水稻葉片中葉綠素含量減少、葉色變淡、分蘗數(shù)增加[14]。目前關(guān)于水稻核-質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過程中的基因機(jī)制研究還處于比較初級(jí)的階段，需要進(jìn)一步挖掘葉色變異材料，更深入地闡述該途徑中的分子機(jī)制。

4 水稻葉色突變體的應(yīng)用與展望

植物葉色突變體是研究光合作用調(diào)控和葉綠體發(fā)育、代謝途徑相關(guān)基因功能的快速有效途徑，目前國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過190個(gè)水稻葉色變異突變體，通過圖位克隆的方法獲得突變基因，并利用分子遺傳學(xué)對(duì)基因的功能進(jìn)行了闡述，這些基因?yàn)槿~綠體的發(fā)育機(jī)制及光合作用的調(diào)控機(jī)理提供新的分子依據(jù)。

筆者所在課題組于2015年在中熟中粳稻鹽稻8號(hào)提純復(fù)壯的試驗(yàn)田中發(fā)現(xiàn)1株衰老明顯延緩的滯綠突變體，可以作為優(yōu)良的種質(zhì)資源加以利用。經(jīng)連續(xù)多年的種植，表型穩(wěn)定遺傳，在自然條件下，突變體在苗期、分蘗期、灌漿初期的表型與野生型鹽稻8號(hào)無顯著差異，但在灌漿后期葉色仍保持濃綠，尤其是千粒質(zhì)量極顯著高于野生型。將該基因定位在第4染色體遺傳距離為4.6 cM范圍內(nèi)，目前正在進(jìn)行精細(xì)定位。同時(shí)以突變體為親本配置了大量雜交組合，利用分子標(biāo)記輔助選擇將有利基因進(jìn)行聚合育種，以其為培育高產(chǎn)水稻品種提供種質(zhì)資源。目前已有研究者將葉色變異作為標(biāo)記導(dǎo)入雜交水稻的母本當(dāng)中，在雜交制種苗期就可以輕易的去除雜株，從而保持種子的純度[46]。

雖然目前已經(jīng)克隆了大量的水稻葉色突變基因，有關(guān)葉綠體發(fā)育、代謝途徑及光合作用調(diào)控機(jī)理研究取得了不少進(jìn)展，但葉綠體是一個(gè)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的亞細(xì)胞系統(tǒng)，還存在許多未知的途徑，所以葉綠體的發(fā)育機(jī)制及光合作用的調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步的研究。需要學(xué)者發(fā)現(xiàn)更多的葉色變異，從基因?qū)用嫔细牧嫁r(nóng)作物，獲得高光效的作物新品種，這對(duì)于保證我國糧食產(chǎn)量、促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和諧發(fā)展具有重要意義。