制動(dòng)致福利受損大鼠部分行為學(xué)改變及其體內(nèi)NF-κB的變化*

董 敏 梁 磊 尤金煒 馬 暢 張旭亮 惲?xí)r鋒

(南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科，全軍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科普與倫理教育基地，全國(guó)科普教育基地，南京 210002)

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的重要組成部分[1]。福利受損不僅可引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化，而且可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)毛色、精神狀態(tài)的改變，甚至行為異常，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。動(dòng)物福利評(píng)估是保障實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利的重要方法[1-2]。

評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利水平的方式有多種，但目前尚無特異性指標(biāo)和統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。以往研究多利用基礎(chǔ)生理生化或內(nèi)分泌等方面的指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，而研究行為學(xué)數(shù)據(jù)同時(shí)觀測(cè)NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)的報(bào)道較少[2-4]。

本實(shí)驗(yàn)以常見的SD大鼠為研究對(duì)象，以束縛制動(dòng)致其福利受損，通過經(jīng)典的行為學(xué)方法“曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)”和“O迷宮”，觀察了制動(dòng)致福利受損大鼠部分行為學(xué)改變，同時(shí)對(duì)大鼠肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB mRNA轉(zhuǎn)錄水平及蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF級(jí)雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量約200 g，由南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供[SCXK(軍)2012-0014]，使用許可證[SYXK(軍)2012-0047]。60Co滅菌全價(jià)顆粒飼料與高溫高壓滅菌飲用水，自由采食。

1.1.2主要儀器和試劑:冰凍離心機(jī)(Heal Force，Neofuge 15R)，Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies，15596-026)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，#K1622)，PCR儀(ABI，Step One Plus)，熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)(Roche LightCyclery 96)動(dòng)物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)(Noldus Information Technology，Etho Vision XT，The Netherlands)；一抗HRP標(biāo)記山羊抗兔(武漢谷歌生物科技有限公司，GB23303)、二抗HRP標(biāo)記驢抗山羊(武漢谷歌生物科技有限公司，GB23404)、Protein Marker(Thermo，26616)，Acr、Bis、Tris、TWEEN 20(Solarbio)，PVDF膜(Millipore)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、垂直電泳系統(tǒng)(BIO-RAD)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)處理: 48只SD大鼠給予管狀容器制動(dòng)，每日固定時(shí)間上、下午各1 h，并于制動(dòng)的第0、1、3、7、10、14天隨即抽取8只動(dòng)物進(jìn)行曠場(chǎng)和O迷宮實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)后取材，用于指標(biāo)測(cè)定。其中第0天的8只動(dòng)物未束縛刺激，作為空白對(duì)照，每次抽樣檢測(cè)樣本量n=8[5]。

1.2.2指標(biāo)測(cè)定

1.2.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝細(xì)胞NF-κB p65 mRNA相對(duì)含量：取大鼠肝臟組織，充分裂解后按Trizol操作說明提取總RNA。而后按照Thermo#K1622反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明操作，反轉(zhuǎn)錄cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL，每管加入總RNA 4μg，37℃反應(yīng)1 h，70℃15 min。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，引物(Invitrogen Biotechnology Co., LTD提供)為：p65上游引物 5′-AAGCACAGATA CCACCAAGACAC-3′，下游引物 5′-CGCACTGCATTC AAGTCATAGTC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度324 bp，退火溫度60℃；GAPDH上游引物 5′-GTGACGTTG ACATCCGTAAAGA-3′，下游引物 5′-GTAACAGTCC GCCTAGAAGCAC-3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度287 bp，退火溫度60℃。

反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，加入Nuclease-Free Water至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，(95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s)×40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品3次重復(fù)。將空白組大鼠基因表達(dá)水平定為1，比較其他組別的基因表達(dá)差異。

1.2.2.2 Western blot檢測(cè)肝細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)：取肝臟組織，裂解細(xì)胞提取總蛋白。10%SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，一抗4 ℃過夜，二抗37 ℃反應(yīng)1 h，洗膜ECL顯影。以GAPDH為內(nèi)參照，每組樣本進(jìn)行3次重復(fù)，以p65蛋白條帶灰度與對(duì)應(yīng)GAPDH條帶灰度的比值顯示p65蛋白的表達(dá)水平。

1.2.2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(Open-field Test)：參照王少華和吳凡等的實(shí)驗(yàn)方法[6-7]。曠場(chǎng)為不透明材料制成的箱式容器，尺寸為50 cm×50 cm×30 cm，箱底劃分為等面積的25個(gè)正方形方格，四周有高30 cm的黑色周壁，無頂。實(shí)驗(yàn)時(shí)光照設(shè)置為黑夜模式，背景噪聲控制在65 dB以下，從同一位置將大鼠放入中央格，采用動(dòng)物行為學(xué)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄每只大鼠10 min內(nèi)的行進(jìn)總路程、平均速度、中央活動(dòng)路程及中央活動(dòng)時(shí)間。每檢測(cè)一只大鼠后使用酒精清理實(shí)驗(yàn)箱，避免遺留糞便、氣味等影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2.4 O迷宮(Elevated O-maze Test)：高架O迷宮實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8]。實(shí)驗(yàn)時(shí)將大鼠面對(duì)閉臂區(qū)間放置于開臂區(qū)間與閉臂區(qū)間的接點(diǎn)處，記錄5 min內(nèi)大鼠進(jìn)入開臂區(qū)間的次數(shù)及停留時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 外觀比較

實(shí)驗(yàn)初期，大鼠進(jìn)食正常，雙目有神，反應(yīng)靈敏，毛色柔順光亮。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，大鼠逐漸出現(xiàn)不同程度的反應(yīng)遲鈍，易怒，攻擊性增強(qiáng)，毛色雜亂暗沉。

2.2 NF-κB p65 mRNA 轉(zhuǎn)錄

實(shí)時(shí)熒光定量PCR目的基因NF-κB p65和內(nèi)參GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，引物擴(kuò)增效率為99.6%。結(jié)果如圖1所示，隨著束縛時(shí)間的延長(zhǎng)，SD大鼠肝細(xì)胞NF-κB p65的mRNA水平逐漸升高，從束縛3 d開始即顯示出顯著差異(P<0.05)，至束縛14 d時(shí)，與束縛前比較，差異已極其顯著(P<0.01)。

圖1 不同束縛時(shí)間大鼠肝細(xì)胞NF-κB p65基因表達(dá)注：*表明與束縛前比較，*P<0.05，**P<0.01 (n=8)Fig.1 Gene expression of NF-κB p65 in liverNote: *means compare with mock group,*P<0.05，**P<0.01 (n=8)

2.3 NF-κB 蛋白表達(dá)

結(jié)果如圖2所示。對(duì)各個(gè)組別的相對(duì)灰度比值進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析后，表明第3、7、10、14天的NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著高于束縛前(P<0.05)，其中第14天的蛋白表達(dá)差異極其顯著(P<0.01)。

表1 大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Open-field test result

注：*表示與空白比較，*P<0.05；^表示與束縛1 d比較，^P<0.05；#表示與束縛3 d比較，#P<0.05；□表示與束縛7 d比較，□P<0.05(n=8)

Note：Compare with control,*P<0.05；Compare with restrain 1d,^P<0.05；Compare with restrain 3d,#P<0.05；Compare with restrain 7d,□P<0.05 (n=8)

圖2 不同束縛時(shí)間大鼠肝細(xì)胞NF-κB p65蛋白表達(dá)注：*表明與束縛前比較，*P<0.05，**P<0.01 (n=8)Fig.2 Protein expression of NF-κB p65 in liverNote: * means compare with mock group,*P<0.05，**P<0.01 (n=8)

2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如表1所示，束縛1至7 d，SD大鼠的活動(dòng)性與束縛前相比均出現(xiàn)不同程度的降低，同時(shí)隨著束縛時(shí)間的增加，活動(dòng)性的降低情況逐漸加重，但尚未表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。束縛10、14 d時(shí)，大鼠的活動(dòng)性降低情況愈加嚴(yán)重，并表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。

2.5 O迷宮實(shí)驗(yàn)

結(jié)果如表2所示，大鼠經(jīng)束縛10 d至14 d后，在迷宮中的行進(jìn)速度開始與束縛1至7 d產(chǎn)生差異(P<0.05)。束縛1 d后，大鼠進(jìn)入開臂的時(shí)間即顯著縮短(P<0.05)，束縛10 d以上后，差異與空白組相比已極其顯著(P<0.01)，同時(shí)也與其他束縛組產(chǎn)生差異(P<0.05)；同樣,大鼠停留于開臂的時(shí)間，經(jīng)束縛1 d后即產(chǎn)生差異(P<0.05)，并隨束縛時(shí)間增加而逐步減少，同時(shí)差異性變化也更為顯著。

表2 大鼠O迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Elevated o-maze test Result

注：*表示與空白比較，*P<0.05,**P<0.01；^表示與束縛1 d比較，^P<0.05；#表示與束縛3 d比較，#P<0.05；□表示與束縛7 d比較，□P<0.05 (n=8)

Note：Compare with control,*P<0.05,**P<0.01；Compare with restrain 1d,^P<0.05；Compare with restrain 3d,#P<0.05；Compare with restrain 7d,□P<0.05 (n=8)

3 討論

利用基礎(chǔ)生理生化、內(nèi)分泌、免疫學(xué)等指標(biāo)對(duì)動(dòng)物福利水平進(jìn)行評(píng)估是目前最常用的福利評(píng)估方法[3]，但由于在采集這些數(shù)據(jù)的過程中，創(chuàng)傷等各類操作會(huì)不同程度刺激實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，造成動(dòng)物福利受損，同時(shí)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差[3-4]。而利用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行為學(xué)數(shù)據(jù)的評(píng)估方法不僅具有便捷、可靠的優(yōu)點(diǎn)，還能避免上述問題。另外，前述有創(chuàng)刺激評(píng)價(jià)方法在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)動(dòng)物福利已然受損、靶器官已受損害，動(dòng)物健康或?qū)嶒?yàn)結(jié)果已發(fā)生不可逆影響。而行為學(xué)的評(píng)價(jià)能否在福利受損早期觀察出動(dòng)物的變化而進(jìn)行干預(yù)，尚不得而知。近幾年來，梁磊等[5]利用NF-κB 的檢測(cè)對(duì)動(dòng)物福利早期受損進(jìn)行評(píng)估，取得了較好的效果，本文利用動(dòng)物制動(dòng)術(shù)建立了福利受損模型，利用曠場(chǎng)行為分析和O迷宮實(shí)驗(yàn)研究不同福利受損程度對(duì)大鼠行為學(xué)的影響，同時(shí)觀測(cè)不同福利損傷情況下大鼠肝臟組織內(nèi)NF-κB的表達(dá)水平，比較二者之間的關(guān)系。

本研究采用了管狀容器制動(dòng)術(shù)作為SD大鼠福利受損模型的制作方法，行為學(xué)評(píng)估使用了曠場(chǎng)行為分析和O迷宮實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物制動(dòng)術(shù)目前廣泛應(yīng)用于身心壓力引發(fā)各類動(dòng)物損害的實(shí)驗(yàn)研究，它可以模擬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的抓取、保定等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成的身心損害，是一種較為常用的輕度福利損害手段，能造成福利水平的下降[2]。曠場(chǎng)行為分析主要反映了動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探索、習(xí)慣及伴隨的情緒變化，通過觀察其在新環(huán)境中的自主行為、探索行為和緊張度等，可反映動(dòng)物的心理狀態(tài)[9-10]。目前一些文獻(xiàn)研究表明，當(dāng)動(dòng)物因應(yīng)激而產(chǎn)生緊張、恐懼情緒時(shí)，會(huì)發(fā)生走格減少以及僵立、蜷臥等現(xiàn)象。從本次曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)，大鼠經(jīng)束縛后，嗅聞、直立等自主活動(dòng)明顯減少，停留于中央格的時(shí)間顯著減少，表明大鼠的探索行為減少，自主活動(dòng)受抑制，興奮性降低。O迷宮實(shí)驗(yàn)根據(jù)動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究特性和高懸敞開臂的恐懼形成矛盾沖突行為來考察動(dòng)物的焦慮情況，常用于焦慮和恐懼的情緒評(píng)價(jià)[11]。本次O迷宮實(shí)驗(yàn)中，束縛后大鼠長(zhǎng)時(shí)間停留于閉臂中，進(jìn)入開放臂的次數(shù)及停留時(shí)間顯著下降，表明大鼠緊張和焦慮程度增加，對(duì)開放性場(chǎng)所持恐懼態(tài)度，因而長(zhǎng)時(shí)間躲藏于閉臂中。

NF-κB是1986年Sen和Baltimore在B淋巴細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一類能和免疫球蛋白κ輕鏈基因的增強(qiáng)子特異結(jié)合的核因子，廣泛存在于各種真核細(xì)胞中，其活化時(shí)在機(jī)體內(nèi)環(huán)境多個(gè)自我調(diào)節(jié)過程中起關(guān)鍵作用[12]。多種因素均可引起NF-κB水平上調(diào)，如細(xì)菌、病毒、紫外線、TNF-α、放射性物質(zhì)等，其中應(yīng)激也是引起其水平上調(diào)的重要因素[13]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在束縛應(yīng)激刺激造成的福利損傷過程中，SD大鼠肝臟NF-κB的表達(dá)水平不斷增高，大鼠活動(dòng)興趣和活動(dòng)能力呈明顯降低趨勢(shì)。這與以往文獻(xiàn)的報(bào)道相類似。

結(jié)果還顯示，束縛應(yīng)激干預(yù)第3天，即當(dāng)出現(xiàn)福利輕度受損時(shí)大鼠即出現(xiàn)體內(nèi)NF-κB表達(dá)水平增高，但此時(shí)行為學(xué)指標(biāo)的變化尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨著刺激天數(shù)的增加，在束縛時(shí)間達(dá)到10天時(shí)，NF-κB表達(dá)增高的趨勢(shì)進(jìn)一步加劇，同時(shí)大鼠出現(xiàn)了明顯的行為異常。該結(jié)果提示，在福利受損的早期或輕度福利受損狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首先出現(xiàn)的是機(jī)體NF-κB表達(dá)的改變。當(dāng)福利受損持續(xù)到一定時(shí)間或加重至一定程度，即出現(xiàn)自主行為受抑制以及焦慮程度上升等一系列行為學(xué)改變。

綜上所述，研究結(jié)果表明，在福利受損的早期或輕度福利受損狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物首先出現(xiàn)的是機(jī)體NF-κB表達(dá)的改變，然后才是機(jī)體行為學(xué)及其它功能的改變。而NF-κB 的改變能否作為動(dòng)物福利受損的早期或預(yù)警指標(biāo)，或者嘗試在后期的實(shí)驗(yàn)中加以干預(yù)阻斷福利受損路徑而使動(dòng)物福利得以改善，從而使動(dòng)物健康或?qū)嶒?yàn)結(jié)果不受影響尚待探討。