藏族高原適應(yīng)性相關(guān)研究及法醫(yī)學(xué)應(yīng)用展望

黃美莎 ，江 麗 ，劉 京 ，唐光峰 ，許 杰 ，王 玲 ，趙 慧 ，李彩霞 ,,*

（1. 山西醫(yī)科大學(xué)，太原 030001；2. 公安部物證鑒定中心，北京市現(xiàn)場(chǎng)物證檢驗(yàn)工程技術(shù)研究中心，法醫(yī)遺傳學(xué)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，現(xiàn)場(chǎng)物證溯源技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100038；3. 山東省泰安市公安局，山東泰安 271000）

伴隨不同國(guó)家或區(qū)域間的人員流動(dòng)顯著增加，涉外反恐、跨區(qū)域流動(dòng)作案等復(fù)雜案件逐年增多。如果能夠通過現(xiàn)場(chǎng)遺留DNA的分析獲取人員身份、種族和地域來(lái)源等信息，將能對(duì)案件定性、偵辦等提供重要的科學(xué)線索，至少也可縮小偵察范圍，便于現(xiàn)場(chǎng)勘查、警情處理和人員調(diào)動(dòng)等工作的開展。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是基因組中單個(gè)堿基變異形成的一種多態(tài)性，廣泛分布在基因組的編碼區(qū)和非編碼區(qū)，蘊(yùn)含大量與人的表型特征等相關(guān)的信息，可用于群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、疾病關(guān)聯(lián)研究等。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，SNPs是常用的一種祖先信息位點(diǎn)(ancestry informative markers,AIMs)，可用于DNA供者的族群地域推斷[1]，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道了大量的AIMs組合用于區(qū)分歐、東亞、非洲等洲際大跨度人群及混合人群[2-4]，但是，對(duì)于東亞地區(qū)尤其是我國(guó)亞人群的族群推斷體系罕有報(bào)道。藏族是典型的高原人群，其全基因組關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)EPAS1、EGLN1、PPARA等基因與藏族人群的高原適應(yīng)性有關(guān)，這些基因上有大量的SNP位點(diǎn)，在高原和平原人群之間存在頻率差異[5-17]，藏族人群高原適應(yīng)性遺傳機(jī)理的研究對(duì)于其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用具有重要的基礎(chǔ)作用。

1 藏族人群高原適應(yīng)性相關(guān)研究

1.1 高原適應(yīng)性相關(guān)生理機(jī)能變化

藏族人群約在兩萬(wàn)年前就定居于青藏高原（海拔3000～5000 m），是典型的高原人群。我國(guó)境內(nèi)藏族人口約680萬(wàn)，主要分布在西藏自治區(qū)、四川、云南以及青海、甘肅等地。另外，尼泊爾、巴基斯坦、印度、不丹等國(guó)境內(nèi)也分布著藏族人群。藏語(yǔ)屬于漢藏語(yǔ)系藏緬語(yǔ)族藏語(yǔ)支。平原人初入高海拔地區(qū)（海拔大于等于3000 m）會(huì)出現(xiàn)高原反應(yīng)，表現(xiàn)為頭痛、睡眠障礙、惡心、嘔吐、胸悶、氣短、心悸等。相反，即便是久居低海拔地區(qū)的藏族人到海拔3700 m時(shí)心率也無(wú)明顯變化[18]。低海拔地區(qū)的人群進(jìn)駐高原后，機(jī)體通過血紅蛋白濃度代償性增高來(lái)適應(yīng)低氧環(huán)境，血紅蛋白的過度增高會(huì)導(dǎo)致血液粘稠，進(jìn)而易患慢性高原病(chronic mountain sickness, CMS)。藏族人群世居于高海拔地區(qū)，與進(jìn)駐高原的平原人相比具有較高的血氧飽和度、較高的靜息肺通氣量、缺氧時(shí)較弱的肺血管收縮反應(yīng)以及低水平的血紅蛋白濃度[19-21]，這一系列改變有效地保證了高原人群的正常生活。與同樣居住高海拔地區(qū)的安第斯山人相比，兩者具有不同的適應(yīng)機(jī)制，相關(guān)研究表明，同一海拔情況下藏族人的靜息肺通氣量比安第斯山人高一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，但是藏族人的血紅蛋白濃度比安第斯山人低一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差。西藏、青海、四川、云南以及印度藏族的ABO血型分布也具有差異性[22]。這些都反映了高原適應(yīng)具有明顯的地域差異，也表明了青藏高原地區(qū)藏族的獨(dú)特性。

1.2 高原適應(yīng)性相關(guān)基因研究

藏族人在高原適應(yīng)方面具有遺傳學(xué)基礎(chǔ)[6-8,10,16]。缺氧誘導(dǎo)因子通路（hypoxia-inducible factor (HIF)pathway）是機(jī)體調(diào)控氧平衡的主要信號(hào)通路，也是藏族高原適應(yīng)的關(guān)鍵信號(hào)通路。在藏族人群中，HIF通路通過對(duì)血紅蛋白、血管形成及舒縮等血液相關(guān)基因的調(diào)控，提高了血紅蛋白的攜氧能力；通過對(duì)能量代謝相關(guān)基因（糖酵解酶類、乳酸脫氫酶A、單羧基轉(zhuǎn)運(yùn)體4等）的下調(diào)，降低了機(jī)體新陳代謝水平，減少氧與能量的消耗；通過對(duì)免疫相關(guān)基因調(diào)節(jié)，防止炎癥反應(yīng)，使細(xì)胞避免損傷[23]。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，在HIF通路上發(fā)現(xiàn)大量候選基因在高原和平原人之間存在差異，例如：EGLN1、EPAS1、PPARA、HMOX2、HBG、HBG2、PKLR 等[14,17]，其中，EGLN1和EPAS1兩個(gè)基因位于HIF通路的上游，對(duì)于藏族人的高原適應(yīng)作用比較顯著[5]。EPAS1（Endothelial PAS Domain Protein 1）定位于人染色體2p16-21上，序列長(zhǎng)度約為90kb，直接調(diào)控EPO（紅細(xì)胞生成素）的表達(dá)，在低氧環(huán)境下能夠促進(jìn)EPO的合成進(jìn)而提高血紅蛋白濃度，基因突變后對(duì)缺氧引起血紅蛋白升高反應(yīng)遲鈍。有學(xué)者研究認(rèn)為受到自然選擇的EPAS1基因可能來(lái)源于一種原本生活在歐亞大陸西伯利亞地區(qū)的古老人群丹尼索瓦人的基因滲入，藏族人群90%以上攜帶有此序列的基因，漢族人群中這一基因的比例較小[9]。EGLN1（egl nine homolog 1）是一種雙加氧酶的氧感受器，對(duì)EPAS1具有負(fù)向調(diào)控作用，基因突變后提高EGLN1酶的活性，從而促進(jìn)EPAS1的降解，在低氧環(huán)境下EPO的表達(dá)減少[10]。藏族人因?yàn)镋GLN1、EPAS1等基因上存在大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，對(duì)低氧誘導(dǎo)的反應(yīng)相對(duì)遲鈍，血紅蛋白濃度即使在高海拔情況下依然保持相對(duì)穩(wěn)定的水平，進(jìn)而與平原漢族相比不易患高原病[15]。Laura等[24-25]對(duì)西藏的藏族人群和安第斯山人群的高原適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了比較分析，西藏藏族人群高原適應(yīng)性相關(guān)基因主要為EPAS1和EGLN1，而安第斯山人群與高原適應(yīng)最相關(guān)的基因?yàn)镻RKAA1和NOS2A，研究表明西藏藏族人群和安第斯山人群高原適應(yīng)候選基因存在差異。

1.3 高原適應(yīng)相關(guān)SNP研究

全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了大量藏族人群與平原人群之間存在有顯著差異的SNP位點(diǎn)。Huerta-Sanchez等[9]通過對(duì)各40個(gè)藏、漢族個(gè)體的EPAS1基因重測(cè)序發(fā)現(xiàn)了一種獨(dú)特的單倍型，這種單倍型由5個(gè)SNPs位點(diǎn)形成，即rs115321619、rs73926263、rs73926264、rs73926265、rs55981512，此單倍型（AGG AA）只存在于藏族人和丹尼索瓦人中，而在40個(gè)漢族個(gè)體中均未檢出；EPAS1上的rs1562453在西藏藏族、青海藏族與漢族間等位基因頻率具有顯著差異，但是在云南藏族和漢族間等位基因頻率差異不顯著，這進(jìn)一步說(shuō)明了同屬高海拔的藏族也存在地域的差異性，說(shuō)明高原環(huán)境對(duì)世居人群EPAS1基因有選擇作用[26]；此外，EPAS1上的rs13419896、rs4953354和1868092在藏族與非藏族人群間具有顯著差異[13]。Xiang等[10]通過EGLN1基因重測(cè)序技術(shù)共檢測(cè)到185個(gè)差異位點(diǎn)，其中rs18699510（D4E）是一種非同義突變，其在藏族與平原人群間顯示出非常大的分布差異，在藏族和漢族人之間的FST值達(dá)到0.709，藏族人中的平均檢出率為70.9%，而在漢族、日本、歐洲和非洲等平原人群中非常稀少，檢出率僅為0.56%～2.27%，是典型的自然選擇差異位點(diǎn)，具有類似特點(diǎn)的SNP位點(diǎn)還有rs12097901。通過單倍型網(wǎng)絡(luò)分析，在EPAS1和EGLN1基因上還發(fā)現(xiàn)了大量與平原人群有差異的單倍型[10]。再者，EPAS1和EGLN1上存在有與急性高山?。╝cute mountain sickness, AMS） 相 關(guān) 的 SNPs位 點(diǎn)。EPAS1上 的rs4953348位點(diǎn)多態(tài)性與AMS發(fā)病易感性相關(guān)，GG（鳥苷酸純合子）基因型頻率在病例組中遠(yuǎn)高于其對(duì)照組值（53.8%vs38.4%），并且藏族人群中的腺苷酸A等位基因占主導(dǎo)[27]，平原漢族人群攜帶GG基因型則患AMS的風(fēng)險(xiǎn)大[28]。EGLN1上的rs480902的TT（胸腺嘧啶核苷酸純合子）基因型在AMS患者中頻率高于高原藏族人群[29]，以上研究說(shuō)明平原漢族中AMS易感人群攜帶的SNP位點(diǎn)基因型頻率要高于藏族人群。

2 法醫(yī)學(xué)應(yīng)用展望

用一組群體間基因頻率差異顯著的DNA多態(tài)性位點(diǎn)可以進(jìn)行人群遺傳結(jié)構(gòu)的區(qū)分[1]。法醫(yī)學(xué)群體來(lái)源推斷相關(guān)研究[2-4]的一般策略如下：首先，使用高通量SNP檢測(cè)技術(shù)對(duì)人群間頻率差異顯著的SNPs位點(diǎn)進(jìn)行大量選擇，例如全基因組芯片技術(shù)和新一代測(cè)序技術(shù)等，或者通過文獻(xiàn)報(bào)道獲得差異性位點(diǎn)。然后，對(duì)差異性位點(diǎn)進(jìn)行群體間遺傳多態(tài)性及遺傳結(jié)構(gòu)比較分析。最終，進(jìn)行種族推斷復(fù)合檢測(cè)體系的構(gòu)建。本項(xiàng)目組此前就構(gòu)建了27重SNP復(fù)合檢測(cè)體系，用于歐洲、非洲、亞洲人群的遺傳結(jié)構(gòu)分析和個(gè)體的種族推斷[2]。

上述相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了高原適應(yīng)基因中存在藏族與其他人群間頻率差異顯著的SNPs位點(diǎn)，這些位點(diǎn)是依據(jù)群體來(lái)源推斷策略進(jìn)行法醫(yī)學(xué)DNA群體信息特征刻畫研究的理論前提。目前，法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已有研究報(bào)道，對(duì)高原適應(yīng)基因的人群差異性SNPs位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合體系構(gòu)建和多態(tài)性評(píng)估。例如，楊鑫等[30]基于EPAS1和EGLN1中的10個(gè)SNPs位點(diǎn)（rs12907901、rs13419896、rs150877473、rs1562453、rs1 86996510、rs2491406、rs2491407、rs4953360、rs4953361、rs758962），利用SNaPshot 多重分析試劑盒獲得了518名甘肅、青海無(wú)關(guān)藏族個(gè)體和134名平原漢族無(wú)關(guān)個(gè)體的等位基因分型?；诨蝾l率分析發(fā)現(xiàn)，藏漢人群在4個(gè)SNPs位點(diǎn)上存在顯著差異（rs150877473、rs1562453、rs186996510、rs7589 621），此研究采用SNaPshot技術(shù)[31]基于PCR-CE平臺(tái)進(jìn)行復(fù)合體系構(gòu)建。我國(guó)公安系統(tǒng)大部分物證鑒定實(shí)驗(yàn)室配備有3130、3500等毛細(xì)管電泳儀，而SNaPshot技術(shù)操作簡(jiǎn)單，可快速掌握，故易于普及和推廣?？傊瑢⒉刈逄禺愋許NPs位點(diǎn)用于法醫(yī)學(xué)種族推斷研究無(wú)論在理論還是技術(shù)上均具有可行性。

3 結(jié)論

綜上所述，生活在高原地區(qū)的藏族以其獨(dú)特的生理機(jī)能變化適應(yīng)了高原低氧環(huán)境，由于自然選擇等因素，在EPAS1、EGLN1等基因上存在有大量為高原人群所特有的差異位點(diǎn)。據(jù)此，通過高通量的SNP檢測(cè)技術(shù)篩選出高原與平原人群間差異顯著的這些高信息量位點(diǎn)，進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析、未知個(gè)體種族推斷等法醫(yī)學(xué)研究，具可行性。