油棕葉片冷凍切片技術(shù)研究

張大鵬 馮美利 秦海棠 王永 曹紅星

摘? 要? 為了便于研究油棕葉片的解剖結(jié)構(gòu)，獲得高質(zhì)量的冷凍切片，對(duì)油棕葉片冷凍切片關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行研究，優(yōu)化了快速觀測(cè)油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的冷凍切片方法。結(jié)果表明：以油棕嫩葉為實(shí)驗(yàn)材料，初切成2 mm×2 mm規(guī)格;冷凍包埋塊為5 mm×5 mm，在-30℃冷凍速凍臺(tái)上，設(shè)置冷凍箱-20℃，標(biāo)本頭-10℃，可切出厚度5 μm以上的冷凍切片，切片效果好。該方法可用于研究油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的切片制作和顯微觀測(cè)，在油棕種質(zhì)資源鑒定與評(píng)價(jià)方面有著廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞? 油棕 ;葉片 ;冷凍切片

中圖分類號(hào)? S565.9? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? ? Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.11.016

Frozen Section of Oil Palm Frond

ZHANG Dapeng? FENG Meili? QIN Haitang? WANG Yong? CAO Hongxing

（Coconut Research Institute， CATAS， Wenchang， Hainan 571339）

Abstract? In order to obtain high quality frozen section of oil palm frond to study the frond anatomical structure， the key factors related to frozen section of oil palm frond were analyzed and the frozen section of oil palm frond for quick observation of the frond anatomical structure was optimized. The results showed that the tender oil palm frond of oil palm as experimental material was cut into sections 2 mm×2 mm and embedded 5 mm×5 mm for freezing. In the? -30℃ quick-freezing table， the freezer was set at the temperature of -20℃ and the sample head was -10℃. Under this condition the frozen sections of the oil palm frond were sectioned 5 μm thick or more， with better sectioning effect. This frozen sectioning method could be used for section preparation for microscopic observation of anatomical structure of oil palm frond， and had an wide application value in identification and evaluation of oil palm germplasm resources.

Keywords? oil palm ; frond ; frozen section

油棕（Elaeis guineensis Jacq.）作為世界上產(chǎn)油量最高的木本油料植物之一，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景[1]。然而，中國(guó)油棕產(chǎn)業(yè)起步較晚，大多從國(guó)外引進(jìn)，缺乏自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的品種[2]。引進(jìn)品種需經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間引種試種觀察，才能確定能否在生產(chǎn)上應(yīng)用。因此，有必要對(duì)油棕種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，擇優(yōu)利用。葉片解剖結(jié)構(gòu)作為鑒定種質(zhì)資源的重要依據(jù)之一[3-6]，其快速獲取切片的方法有利于提高油棕種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)效率，在鑒定評(píng)價(jià)油棕種質(zhì)方面有重要的應(yīng)用價(jià)值。

石蠟切片作為植物切片的主要技術(shù)，因前處理時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)[7]，不利于油棕種質(zhì)資源進(jìn)行大批量快速鑒定，而冷凍切片技術(shù)正好彌補(bǔ)了這些缺點(diǎn)[8]。但目前該技術(shù)的研究大多用于醫(yī)療診斷動(dòng)物組織[9-12]。雖有少量植物組織冷凍切片的報(bào)道[13-15]，因不同種類的植物組織有不同特性，不同冷凍切片平臺(tái)所用的內(nèi)部冷凍箱和樣品頭等結(jié)構(gòu)也有差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖有借鑒意義，但不能完全應(yīng)用于油棕組織切片研究。因此，選擇適合油棕葉片組織冷凍切片方法、流程及設(shè)置冷凍切片機(jī)中冷凍箱、樣品頭的溫度參數(shù)尤為重要。

本研究以油棕葉片為實(shí)驗(yàn)材料，使用冷凍切片技術(shù)，研究快速獲取油棕葉片冷凍切片的合適方法，探討了快速獲取油棕葉片組織冷凍切片的流程及冷凍切片機(jī)冷凍箱和樣品頭溫度參數(shù)。用于油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的分析，油棕種質(zhì)資源鑒定與評(píng)價(jià)方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所油棕種質(zhì)圃2年齡油棕苗嫩葉為切片材料，包埋劑采用美國(guó)櫻花公司OCT冷凍包埋劑;冷凍切片機(jī)及顯微鏡型號(hào)分別為L(zhǎng)eica CM 1900、Leica DM 2500;分析純甘油封片。

1.2? 方法

1.2.1? 冷凍箱及標(biāo)本頭溫度參數(shù)優(yōu)化

冷凍切片機(jī)有3部分可以調(diào)節(jié)溫度，分別為冷凍箱（0～-35℃）、速凍臺(tái)（0～-45℃）、標(biāo)本頭（0～-50℃）。

基于前期分析，冷凍箱、速凍臺(tái)和標(biāo)本頭的優(yōu)化方案為：速凍臺(tái)溫度設(shè)為定量即-30℃，以便快速固定試壓材料;冷凍箱、標(biāo)本頭設(shè)為變量，即-5、-10、-20℃，用于篩選最優(yōu)溫度。

1.2.2? 切片厚度的對(duì)比

預(yù)制包埋盒規(guī)格為5 mm×5 mm×5 mm，將待測(cè)葉片切成2 mm×2 mm規(guī)格，將初切葉片置于已加入OCT包埋劑的包埋盒中，放置在冷凍切片機(jī)內(nèi)速凍臺(tái)上完成固定包埋。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果設(shè)置冷凍切片機(jī)參數(shù)，樣品頭上初修包埋塊大小，將待切面修整為以葉片材料為中心的3 mm×3 mm規(guī)格。取5、20、40、60 μm厚度的切片，比較觀片效果。

1.2.3? 切片后滴加甘油的不同處理設(shè)計(jì)

用載玻片粘取切片，在加蓋玻片的階段滴加甘油封片，比較立即滴加、遲加、不加甘油3處理的觀片效果，確定最佳的甘油處理。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 冷凍切片機(jī)速凍臺(tái)、標(biāo)本頭溫度參數(shù)的優(yōu)化及切片后效果

由表1可知。在不同溫度下，冷凍包埋劑隨著溫度的下降硬度增強(qiáng)，較高（-5℃）和較低溫度（-20℃）時(shí)，冷凍切片厚度均難控制。其中，冷凍箱和標(biāo)本頭均為-5℃時(shí)，包埋塊較軟;均為-20℃時(shí)，包埋塊較硬，均不利于控制油棕葉片冷凍切片厚度。而標(biāo)本頭為-10℃、冷凍箱為-20℃條件下，可以切得厚度5 μm的切片。

高等植物中，細(xì)胞的直徑通常為10～100 μm[16]。研究發(fā)現(xiàn)，油棕葉片表皮、柵欄和海綿組織細(xì)胞的近似直徑分別約為10、25、15 μm。由此可知，厚度5 μm的切片可獲得單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，便于油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的觀察和分析。

由圖1可知，經(jīng)過(guò)染色處理的石蠟切片葉肉細(xì)胞較清晰，視野有分層感，獲取切片的時(shí)間長(zhǎng);冷凍切片獲取快速，視野清晰無(wú)分層感，具有良好的觀測(cè)效果，可根據(jù)需要進(jìn)行染色、制作永久切片。

2.2? 不同厚度切片的對(duì)比

由圖2可知，切片清晰程度隨切片厚度的增加逐漸降低，5 μm切片（A）的解剖結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn);20 μm厚度切片（B）視野模糊，難以用于分析葉片的解剖結(jié)構(gòu);40、60 μm厚度切片（C、D）已無(wú)法用于觀測(cè)。

2.3? 滴加甘油的不同處理結(jié)果

由圖3可知，立即滴加甘油加蓋玻片（A）可以獲得視野清晰、葉片結(jié)構(gòu)完整的冷凍切片，有助于油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)的研究與分析;延遲滴加甘油（B）不利于蓋玻片加蓋，易產(chǎn)生氣泡進(jìn)而影響觀測(cè)、分析和葉片解剖結(jié)構(gòu)圖片的獲取;不滴加甘油（C）則會(huì)導(dǎo)致切片失水，葉片解剖結(jié)構(gòu)被破壞，進(jìn)而顯微觀測(cè)失真，不利于葉片組織內(nèi)部柵欄組織、海綿組織的觀測(cè)與分析。

3? 討論與結(jié)論

冷凍切片技術(shù)多用于人體或其他動(dòng)物器官的醫(yī)學(xué)研究[17-18]，應(yīng)用于植物組織方面不多[19]。本研究所得到的參數(shù)雖可獲得較好的油棕葉片切片，但仍屬于初級(jí)研究階段，與石蠟切片技術(shù)相比，還可在染色、烘干、永久切片等方面進(jìn)行后續(xù)研究。因組織物理特性不同，要獲得油棕的根、莖、葉、花、胚等其它組織的冷凍切片，應(yīng)分別研究。本研究相關(guān)結(jié)果可作為研究其它植物葉片冷凍切片的初始操作參考，再進(jìn)行優(yōu)化以獲得最適步驟和參數(shù)。本研究表明：以油棕鮮葉為試驗(yàn)材料，在冷凍速凍臺(tái)設(shè)定為-30℃;冷凍箱為-20℃;標(biāo)本頭為-10℃條件下，可切出5 μm以上厚度的冷凍切片。該方法彌補(bǔ)其它切片技術(shù)所存在的組織前處理時(shí)間長(zhǎng)、繁瑣等問(wèn)題，也可進(jìn)行染色及永久切片處理，其獲得的切片清晰完整，有利于快速分析油棕葉片解剖結(jié)構(gòu)，對(duì)培育或篩選適合我國(guó)栽培的油棕種質(zhì)資源具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)

[1] 張大鵬，王? 永，石? 鵬，等. 油棕組培苗Mantled變異研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，37（12）：52-55.

[2] 林位夫，曾憲海，張希財(cái)，等. 我國(guó)熱區(qū)油棕種植生產(chǎn)潛力研究[J]. 中國(guó)科技成果，2016（24）：12，17.

[3] 李芳蘭，包維楷. 植物葉片形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)與適應(yīng)[J]. 植物學(xué)報(bào)，2005，22（增刊）：118-127.

[4] 伍寶朵，范? 睿，胡麗松，等. 不同低溫脅迫條件下胡椒葉片生理生化及結(jié)構(gòu)分析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（1）：66-71

[5] 何海旺，趙? 明，武? 鵬，等. 基于香蕉葉片解剖結(jié)構(gòu)的抗寒性評(píng)價(jià)[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，30（1）：193-198.

[6] 何俊平，朱家成，王建平，等. 甘藍(lán)型油菜幼苗顯微組織結(jié)構(gòu)與抗寒性的關(guān)系[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33（1）：19-26.

[7] 楊捷頻. 常規(guī)石蠟切片方法的改良[J].生物學(xué)雜志，2006，23（1）：45-46.

[8] Shiraki T， Kuroda H， Takada A， et al. Intraoperative frozen section diagnosis of bile duct margin for extrahepatic cholangiocarcinoma[J].World Joural of Gastroenterol， 2018（12）： 1 332-1 342.

[9] Hashmi A A， Naz S， Edhi M M，et al. Accuracy of intraoperative frozen section for the evaluation of ovarian neoplasms： an institutional experience[J]. World Joural of Surgical Oncology， 2016（14）： 1-5.

[10] Brajkovic S， Dupouy D G， De L L， et al. Microfluidics for rapid cytokeratin immunohistochemical staining in frozen sections[J].Lab Invest， 2017（97）： 983-991.

[11] Martinelli F， Schmeler K M， Johnson C， et al. Utility of conization with frozen section for intraoperative triage prior to definitive hysterectomy[J].Gynecol Oncol， 2012， 127（2）： 307-311.

[12] Corces M R， Trevino A E， Hamilton E G， et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues[J].Nat Methods， 2017（14）： 959-962.

[13] 陳? 丹，趙? 潔. 適合于植物花器官的冰凍切片技術(shù)[J]. 植物科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，23（3）：285-290.

[14] 李儒海，強(qiáng)? 勝. 雜草果實(shí)的冰凍切片技術(shù)[J]. 植物學(xué)報(bào)，2010，45（6）：739-743.

[15] 李? 賀，劉松梅，孫? 艷，等. 冰凍切片技術(shù)在海濱錦葵細(xì)胞學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 廣西植物，2010，30（2）：170-173.

[16] 陸時(shí)萬(wàn).植物學(xué)（上冊(cè)）[C]. 北京：高等教育出版社，1992

[17] 許? 平，王筱璨，陳奎生，等. 快速冰凍切片制備方法的改進(jìn)[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2010，45（2）：241-243.

[18] Onajin O， Wetter D A， Roenigk R K， et al. Frozen section diagnosis for non-melanoma skin cancers： correlation with permanent section diagnosis[J]. J Cutan Pathol， 2015，42（7）：459-464.

[19] 劉雪輝，張世鑫，楊? 鵬，等. 一種用于觀察木薯顯微結(jié)構(gòu)的冰凍切片技術(shù)[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)，2014，5（1）：67-72.