微生物來源羰基還原酶分子改造研究進(jìn)展

岑佳善，弓添添，陳蔚青，王 普

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015)

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微生物來源羰基還原酶分子改造研究進(jìn)展

岑佳善1，弓添添1，陳蔚青2，王 普1

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江杭州310014；2.浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015)

羰基還原酶具有高度的立體選擇性和催化活性，是生物催化合成手性化合物中應(yīng)用最為廣泛的催化劑之一。由于天然來源的羰基還原酶表達(dá)水平低、分離純化困難以及催化效率不理想等原因，限制了羰基還原酶的工業(yè)化應(yīng)用。利用基因工程技術(shù)對羰基還原酶進(jìn)行分子改造，可顯著提高其催化活性。本文中，筆者就羰基還原酶體外分子改造的不同策略、研究進(jìn)展及其成果進(jìn)行綜述，總結(jié)其分子改造的一般規(guī)律，展望其發(fā)展方向，為微生物來源羰基還原酶的體外分子改造研究提供借鑒。

羰基還原酶；催化機理；定向進(jìn)化；理性設(shè)計

羰基還原酶(carbonyl reductase)因其具有高度的化學(xué)、區(qū)域和立體選擇性，常用于生物催化合成光學(xué)活性手性化合物，在化學(xué)、醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用[1-2]。雖然越來越多的生物催化劑已被應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，但由于自然界的環(huán)境與工業(yè)生產(chǎn)需求上的實際差異，現(xiàn)有的生物催化劑資源并不能完全滿足生物化工產(chǎn)業(yè)的需求。因此，對生物催化劑的改造——體外分子改造技術(shù)應(yīng)運而生[3]，特別是近年來分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，使得在實驗室模擬自然進(jìn)化機制對現(xiàn)有的生物催化劑進(jìn)行人為改造成為可能[4]。積極探索羰基還原酶的分子催化機理，并運用分子生物技術(shù)改造酶的性能，也可為今后基于分子改造創(chuàng)制性能優(yōu)良的新型還原酶催化劑奠定理論基礎(chǔ)[5]。

羰基還原酶在酶學(xué)分類上屬于短鏈脫氫/還原酶類(short-chain dehydrogenases/reduetases,SDR)，為非金屬還原酶，約250個氨基酸殘基，通常以二聚體或四聚體形式存在[6]。SDR擁有3 000多個主要酶蛋白，其中有30多個三維結(jié)構(gòu)編入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB)。雖然不同的酶序列相似度較低(大約在15%～30%)，但位于中心部位的β-夾層結(jié)構(gòu)，其三維結(jié)構(gòu)的α/β-折疊模式具有高度相似性[7]，如人類膽綠素還原酶(PDB:1hdo)和假單胞菌的轉(zhuǎn)錄調(diào)控酶(PDB:1k6x)以SDR作為最優(yōu)同源結(jié)構(gòu)的模式(圖1)。

圖1 SDR的中心β-夾層結(jié)構(gòu)與其最優(yōu) 同源結(jié)構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)關(guān)系Fig.1 Diagram displaying the structural relationship between SDR enzyme along the central (β-sheet) and related structural neighbours

1 催化機理

基于一級結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)的生物信息學(xué)分析，SDR含有保守催化序列Tyr-X-X-X-Lys和N末端NAD(P)H結(jié)合的保守序列Gly-(X)3-Gly-X-Gly。保守催化序列Tyr-(X)3-Lys中的Tyr和Lys與另外的2個氨基酸殘基(Asn和Ser)形成Asn-Ser-Tyr-Lys催化四聯(lián)體。在這催化四聯(lián)體中，Tyr作為最保守的氨基酸殘基，也是主要的催化基團(tuán)，其與底物結(jié)合并發(fā)揮作用；Ser穩(wěn)定底物作用；Lys與輔酶形成氫鍵，且降低Tyr—OH的pKa值[8]。

羰基化合物的羰基C一般呈平面結(jié)構(gòu)，屬于sp2雜化，具有re和si面的兩個非對映面。在還原過程中，NAD(P)H的pro-S氫分別從si面和re面?zhèn)鬟f給底物的羰基，形成S-構(gòu)型的醇，稱為Prelog規(guī)則。而pro-R氫分別從si面和re面?zhèn)鬟f給底物的羰基，形成R-構(gòu)型的醇，稱為反Prelog規(guī)則[9]。

羰基還原酶在催化羰基化合物還原反應(yīng)過程中需要NAD(P)H作為氫或電子傳遞體，在還原酶的作用下，羰基底物從R或S面進(jìn)攻羰基生成相應(yīng)的單一對映體醇，同時NAD(P)H被轉(zhuǎn)化成NAD(P)+。酶反應(yīng)一般遵循順序機制：首先，酶和輔酶形成的“二元復(fù)合物”與底物結(jié)合形成三聯(lián)體中間物；其次，NAD(P)H上的氫轉(zhuǎn)移給底物生成相應(yīng)的醇，同時NAD(P)H變?yōu)镹AD(P)+；最后，酶釋放出產(chǎn)物醇，與NAD(P)+脫離[10]，如圖2所示。

圖2 還原酶順序機制Fig.2 Order mechanism of reductase

2 羰基還原酶的分子改造策略

目前，羰基還原酶的體外分子改造策略主要分為三種：一是基于已知蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和機理的“理性設(shè)計”；二是基于未知蛋白質(zhì)信息的“非理性設(shè)計”；三是將理性設(shè)計與非理性設(shè)計相結(jié)合延伸出的“半理性設(shè)計”[11]。分子改造技術(shù)不僅為研究酶的底物特異性和催化活性位點、改善酶的熱穩(wěn)定性以及提高酶作用溫度等提供了有效手段，更有利于深入了解酶的蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。下面從這三種分子改造策略來分析羰基還原酶體外分子改造的研究進(jìn)展。

2.1 理性設(shè)計策略

理性設(shè)計策略是分子改造的重要手段之一。近年來，由于生物信息學(xué)等相關(guān)學(xué)科的進(jìn)步，理性設(shè)計越來越受到人們的重視，并已取得了可喜的進(jìn)展，在蛋白質(zhì)工程方面的應(yīng)用也愈加廣泛[12]。目前，應(yīng)用較為廣泛的理性設(shè)計策略主要分為基于蛋白質(zhì)構(gòu)象的理性設(shè)計和基于同源建模的理性設(shè)計。

2.1.1 基于蛋白質(zhì)構(gòu)象的理性設(shè)計

基于酶的結(jié)構(gòu)、功能和催化機理等分析酶的不同結(jié)合域?qū)γ复呋钚?、底物特異性和穩(wěn)定性以及對映體選擇性等特性的改造具有指導(dǎo)作用[13]。Jakoblinnert等[14]通過分析近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)羰基還原酶(CPCR2)的蛋白結(jié)構(gòu)(PDB:1R37)，發(fā)現(xiàn)A275位于二聚體界面，接近活性中心且內(nèi)部含有亞基氫鍵，對其進(jìn)行定點突變，得到突變株CPCR2-(A275N,L276Q)，使其酶活和在兩相介質(zhì)中的穩(wěn)定性均提高1.5倍。Zhang等[15]通過分析近平滑假絲酵母羰基還原酶(SCR)蛋白結(jié)構(gòu)得到其輔酶結(jié)合區(qū)域，組合突變點S67D/H68D對羥基苯乙酮催化反應(yīng)速率提高1.9倍，同時對映體選擇性發(fā)生反轉(zhuǎn)。由此可見，通過基于蛋白質(zhì)構(gòu)象的理性設(shè)計，可以有效提高羰基還原酶的穩(wěn)定性和催化特性。

2.1.2 基于同源建模的理性設(shè)計

理性設(shè)計通常需要對酶分子的三維結(jié)構(gòu)有清晰的認(rèn)識，但對于尚未有晶體結(jié)構(gòu)報道的羰基還原酶，只能尋找相似度最高的序列進(jìn)行同源建模[16]。通過軟件模擬進(jìn)行同源建模，考察某氨基酸對目標(biāo)蛋白與底物的影響，再通過突變這些氨基酸以期得到特殊優(yōu)良性狀的菌株。對來自于睪酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)的羰基還原酶，通過酶動力學(xué)、穩(wěn)定性研究以及熒光檢測得到N86、Y155和K159與NADH的結(jié)合作用有關(guān)(圖3)，因此Chang等[17]根據(jù)圖3模擬結(jié)果對其位點進(jìn)行定點突變得到N86A、Y155F和K159A突變體酶，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其催化常數(shù)降低了37～220倍，而解離常數(shù)增加了3～75倍。Heiss等[18]研究嗜熱厭氧乙醇桿菌(Thermoanaerobacterethanolicus)脫氫酶時，以布洛克熱厭氧菌(Thermoanaerobiumbrockii)來源的乙二醇脫氫酶(1YKF.PDB)的蛋白結(jié)構(gòu)為同源模型，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，C295為烷基鍵口袋，其大小決定酮基底物的取向鍵，經(jīng)定點突變后獲得突變株C295A，以此來催化反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)所得產(chǎn)物的對映選擇性發(fā)生反轉(zhuǎn)，而動力學(xué)常數(shù)保持一致。Luo等[19]利用同源建模與分子對接技術(shù)分析乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)醛酮還原酶，發(fā)現(xiàn)其295位和296位氨基酸靠近活性中心，通過兩輪定點突變得到組合突變株KlAKR-Y295W/W296L，研究發(fā)現(xiàn)，其催化效率比野生型提高了11.25倍。同樣，利用同源建模與分子對接技術(shù)，Chao等[20]發(fā)現(xiàn)白毛楊(Populustomentosa)肉桂酰輔酶還原酶(CCR)的192、155和208位氨基酸組成了底物結(jié)合區(qū)域，對其進(jìn)行定點突變，得到催化效率較野生型提高4.7倍的突變酶F155Y。由此可見，在目的酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)不夠明晰的情況下，通過同源建模的理性設(shè)計，亦能達(dá)到改造酶蛋白的目的。

由PyMOL軟件設(shè)計出的源于PDB：1fk8的3α-HSD(/CR)的二維結(jié)構(gòu)，虛線為氫鍵[17]圖3 活性位點N86、Y155和K159與NAD+的結(jié)合構(gòu)型Fig.3 The N86,Y155,and K159 residues interact with NAD+ as shown

2.2 定向進(jìn)化的策略

由于大部分羰基還原酶的晶體結(jié)構(gòu)尚未解析出來，因此，目前的改造工程主要是依靠定向進(jìn)化等非理性手段[21]。定向進(jìn)化主要包括建立突變文庫、選擇合適的表達(dá)體系以及建立快速、高效的高通量篩選方法等[22]。

2.2.1 易錯PCR

采用易錯PCR不需要了解酶蛋白的任何信息，僅需通過改變傳統(tǒng)PCR反應(yīng)體系中的各因素，使堿基隨機引入錯誤而創(chuàng)造序列多樣性文庫[23-24]。Rao等[25]利用易錯PCR方法構(gòu)建了含有3 000多個突變子的文庫，以65 ℃為篩選溫度，獲得了7個熱穩(wěn)定性有所提高的單點突變株，再通過組合飽和突變得到了四點突變株，熱穩(wěn)定性提高了24.7倍。Huang等[26]同樣利用定向進(jìn)化和飽和突變相結(jié)合的方法，將還原酶CgKR1的溶解溫度提高了12 ℃。Machielsen等[27]采用一輪易錯PCR構(gòu)建了1 500個突變子，30 ℃篩選酶活，得到的乙醇脫氫酶突變株對底物2,5-己二酮的催化能力是野生型菌株的10倍。雖然易錯PCR技術(shù)可以達(dá)到定向進(jìn)化的目的，但此方法的關(guān)鍵問題是要有高效的篩選策略。

2.2.2 DNA改組

DNA改組技術(shù)是利用基因重組和重排對某一個酶進(jìn)行改造，同樣不需要知道蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，便可達(dá)到體外進(jìn)化的目的，加速了基因的進(jìn)化程度[28]。金慶超等[28]利用DNA改組技術(shù)研究多種鏈霉菌的spyl調(diào)控基因，篩選得到71個spyl改組基因，接合子的普那霉素Ⅰ產(chǎn)量為出發(fā)菌株的7.5倍。Suzuki等[29]運用DNA改組技術(shù)對嗜熱菌(Thermusthermophilus) HICDH進(jìn)行定向進(jìn)化，得到突變株LR5-1，使其對3-異丙基蘋果酸(3-IPM)的催化效率提高了65倍。

2.2.3 篩選方法的建立

雖然通過定向進(jìn)化可以獲得性狀優(yōu)良的菌株。但是，定向進(jìn)化技術(shù)的成功依賴兩個關(guān)鍵因素，一是建立大容量的突變體庫，二是建立簡單、高效、靈敏和特異性強的篩選方法。目前，常用的突變體篩選方法主要有平板篩選法、熒光法、顯色法以及表面展示技術(shù)[30]。Makino等[31]在平板中進(jìn)行苯乙醛脫氫酶催化2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮和4-氯-乙酰乙酸乙酯的還原反應(yīng)，并添加5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)/四唑硝基藍(lán)(NBT)堿性磷酸酯酶顯色試劑，生成的NADH與BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑反應(yīng)，在菌落上形成不溶性的深藍(lán)色或紫藍(lán)色物質(zhì)，根據(jù)顏色深淺的變化挑取單菌落，以期得到高活力的突變株，從而降低篩選通量。平板篩選方法最為簡便，但局限于提高酶活性等的突變體篩選，對于篩選改變了最適pH和反應(yīng)溫度等條件的突變體，可考慮采用熒光法或顯色法。張航等[32]根據(jù)羰基還原酶催化可逆氧化還原反應(yīng)的原理，耦合偶氮還原酶催化偶氮染料的顏色變化篩選出的突變酶CMCR對產(chǎn)物(S)-1-苯基-1,2-乙二醇的立體選擇性達(dá)到99.9%。

定向進(jìn)化技術(shù)已成為改善酶的催化性能和開發(fā)新型酶蛋白的重要策略，并被應(yīng)用于改善酶的諸多特性，如熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，催化活性和效率等方面[33]。然而，羰基還原酶作為一類重要的生物催化劑，有關(guān)其分子改造的研究報道還不多，同時由于缺乏具有普適性的高通量篩選方法，在改造工程上仍存在一定的難度。表1列舉了部分羰基還原酶定向進(jìn)化的實例。

表1 羰基還原酶的部分定向進(jìn)化實例

2.3 半理性設(shè)計的策略

半理性設(shè)計組合方法較多，除基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析外，還有結(jié)合計算機輔助的半理性設(shè)計[43]。Zhang等[39]通過軟件模擬羰基還原酶催化拆分β-氨基酮，發(fā)現(xiàn)L174處于底物結(jié)合位點，其大小影響底物的取向，經(jīng)飽和突變得到的突變體L174Y可催化得到(R)-型產(chǎn)物，e.e.值為93 %；而L174W催化得到(S)-型產(chǎn)物，e.e.值為96 %。筆者所在課題組采用Discovery Studio 3.0軟件和基于PDB數(shù)據(jù)庫酶蛋白的氨基酸序列比對，以相似度最高的苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)1021的短鏈脫氫酶(PDB:3TOX)和嗜熱菌(Thermusthermophilus)HB8的氧化還原酶(PDB:2D1Y)的晶體結(jié)構(gòu)為模板，對雷弗松氏菌(Leifsoniaxyli)HS0904羰基還原酶LXCAR進(jìn)行同源建模(圖4)。由三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，活性中心附近的Ser154和Leu194可能會影響活性位點，從而影響LXCAR的催化活力，因此對這兩個位點進(jìn)行飽和突變，構(gòu)建飽和突變庫，并從中篩選得到正突變體S154Y，其對底物3,5-雙三氟甲基苯乙酮(BTAP)具有較高的催化活力，酶比活達(dá)到2.89 U/mg，是野生型的1.9倍[40]。

綠色標(biāo)記的為輔酶NADH，藍(lán)色球棍結(jié)構(gòu)是的催化四聯(lián)體(N166-S144-Y157-K161)圖4 同源建模得到的LXCAR三維結(jié)構(gòu)Fig.4 The homology modeled structure of LXCAR describing the NADH (green stick) and the catalytic tetrad (N116-S144-Y157-K161) (blue stick)

3 結(jié)論與展望

近年來，分子改造技術(shù)的日趨成熟，對蛋白質(zhì)工程的發(fā)展產(chǎn)生了巨大的影響，酶基因序列、空間結(jié)構(gòu)及催化方式等信息也逐漸被人們所了解。然而，許多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系還不是很清楚，在進(jìn)行酶分子設(shè)計時具有較大的盲目性。因此，深入研究現(xiàn)有酶的分子結(jié)構(gòu)與功能，利用分子生物學(xué)技術(shù)對具有特殊優(yōu)良性狀的基因進(jìn)行克隆、改造，可提高酶分子設(shè)計的針對性，提高分子改造效率。

一般而言，只要突變體庫足夠大，通過定向進(jìn)化就可以對羰基還原酶多方面的催化性能進(jìn)行改造，從而產(chǎn)生具有優(yōu)良性狀的突變菌株。但是突變體庫越龐大，就越需要高效簡便的高通量篩選方法。構(gòu)建高質(zhì)量、功能豐富的小型庫，可以降低突變體篩選的壓力，反而有可能取得更好的進(jìn)化結(jié)果。因此，建立突變庫高通量篩選方法，快速從突變體庫中篩選出所需的基因是該技術(shù)成功應(yīng)用的關(guān)鍵所在。此外，微生物來源的羰基還原酶分子改造的研究大多以提高其催化效率及酶的熱穩(wěn)定性為主，對底物專一性的改造則相對較少。隨著羰基還原酶應(yīng)用領(lǐng)域的進(jìn)一步拓展，底物分子的多樣性與羰基還原酶底物專一性的矛盾將日漸突出。因此，在注重對羰基還原酶底物專一性改造的同時，也應(yīng)注重篩選和研究還原酶家族中的其他種類羰基還原酶。

[1] MANO J I.Reactive carbonyl species:their production from lipid peroxides,action in environmental stress,and the detoxification mechanism[J].Plant Physiol Biochem,2012,59:90-97.

[2] ZHANG R Z,WANG L,XU Y,et al.In situ expression of (R)-carbonyl reductase rebalancing an asymmetric pathway improves stereoconversion efficiency of racemic mixture to (S)-phenyl-1,2-ethanediol inCandidaparapsilosisCCTCC M203011[J].Microb Cell Fact,2016,15:143-152.

[3] KATAOKA M,MIYAKAWA T,SHIMIZU S,et al.Enzymes useful for chiral compound synthesis:structural biology,directed evolution,and protein engineering for industrial use[J].Appl Microbiol Biotechnol,2016,100(13):5747-5757.

[4] MULLER M,KATZBERG M,BERTAU M,et al.Highly efficient and stereoselective biosynthesis of (2S,5S)-hexanediol with a dehydrogenase fromSaccharomycescerevisiae[J].Org Biomol Chem,2010,8(7):1540-1550.

[5] LI H M,YANG Y,ZHU D M,et al.Highly enantioselective mutant carbonyl reductases created via structure-based site-saturation mutagenesis[J].J Org Chem,2010,75(22):7559-7564.

[6] LODERER C,DHOKE G V,DAVARI M D,et al.Investigationof structural determinants for the substrate specificity in the zinc-dependent alcohol dehydrogenase CPCR2 fromCandidaparapsilosis[J].ChemBioChem,2015,16(10):1512-1519.

[7] OPPERMANN U,FILLING C,HULT M,et al.Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR):the 2002 update[J].Biochemistry,2003,143(18):247-253.

[8] GANI O A,ADEKOYA O A,GIURATO L,et al.Theoretical calculations of the catalytic triad in short-chain alcohol dehydrogenases/reductases[J].Biophys J,2008,94(4):1412-1427.

[9] HUANG M M,HU H H,MA L,et al.Carbon-carbon double-bond reductases in nature[J].Drug Metab Rev,2014,46(3):362-378.

[10] LIANG P,QIN B,MU M,et al.Prelog and anti-Prelog stereoselectivity of two ketoreductases fromCandidaglabrata[J].Biotechnol Lett,2013,35:1469-1473.

[11] 馮旭東,呂波,李春.酶分子穩(wěn)定性改造研究進(jìn)展[J].化工學(xué)報,2016,76(1):277-284.

[12] DENARD C A,REN H Q,ZHAO H M.Improving and repurposing biocatalysts via directed evolution[J].Curr Opin Chem Biol,2015,25:55-64.

[13] GARST A D,BASSALO M C,PINES G,et al.Genome-wide mapping of mutations at single-nucleotide resolution for protein,metabolic and genome engineering[J].Nature Biothchnol,2017,35:48-55.

[14] JAKOBLINNERT A,WITTENBOER A V D,SHIVANGE A V,et al.Design of an activity and stability improved carbonyl reductase fromCandidaparapsilosis[J].J Biotechnol,2013,165:52-62.

[15] ZHANG R Z,XU Y,SUN Y,et al.Ser67Asp and His68Asp substitutions inCandidaparapsilosiscarbonyl reductase alter the coenzyme specificity and enantioselectivity of ketone reduction[J].Appl Environ Microbiol,2009,75(7):2176-2183.

[16] KRIES H,BLOMBERG R,HILVERT D,et al.De novo enzymes by computational design[J].Curr Opin Cheml Biol,2013,17(2):221-228.

[17] CHANG Y H,WANG C Z,CHIU C C,et al.Contributions of active site residues to cofactor binding and catalysis of 3α-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase[J].Biochim Biophys Acta,2010,1804:235-241.

[18] HEISS C,LAIVENIEKS M,ZEIKUS J G,et al.Mutation of cysteine-295 to alanine in secondary alcohol dehydrogenase fromThermoanaerobacterethanolicusaffects the enantioselectivity and substrate specificity of ketone reductions[J].Bioorg Med Chem,2001,9(7):1659-1666.

[19] LUO X,WANG Y J,SHEN W,et al.Activity improvement of aKluyveromyceslactisaldo-keto reductase KIAKR via rational design[J].J Biotechnol,2016,224:20-26.

[20] CHAO N,LI N,QI Q,et al.Characterization of the cinnamoyl-CoA reductaes (CCR) gene family inPopulustomentosareveals the enzymatic active sites and evolution of CCR[J].Planta,2017,245(1):61-75.

[21] KIPNIS Y,DELLUS-GUR E,TAWFIK D S.Trins:a method for gene modification by randomized tandem repeat insertions[J].Protein Eng Des Sel,2012,25(9):437-444.

[22] KOYAMA Y,HIDAKA M,NISHIMOTO M,et al.Directed evolution to enhance thermostability of galacto-N-biose/lacto-N-biose I phosphorylase[J].Protein Eng Des Sel,2013,26(11):755-761.

[23] COBB R E,CHAO R,ZHAO H.Directed evolution:past,present,and future[J].AIChE J,2013,59(5):1432-1440.

[24] ZHAO F J,PEI X Q,REN Z Q,et al.Rapid asymmetric reduction of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate using a thermostabilized mutant of ketoreductase ChKRED20[J].Appl Microbiol Biotechnol,2016,100(8):3567-3575.

[25] RAO G D,LEE J K,ZHAO H M.Directed evolution of phloroglucinol synthase PhlD with increased stability for phloroglucinol production[J].Appl Microbiol Biotechnol,2013,97(13):5861-5867.

[26] HUANG L,XU J H,YU H L.Significantly improved thermostability of a reductase CgKR1 fromCandidaglabratawith a key mutation at Asp138 for enhancing bioreduction of aromatic α-keto esters[J].J Biotechnol,2015,203:54-61.

[27] MACHIELSEN R,LEFERINK N G H,HENDRIKS A,et al.Laboratory evolution ofPyrococcusfuriosusalcohol dehydrogenase to improve the production of (2S,5S)-hexanediol at moderate temperatures[J].Extremophiles,2008,12:587-594.

[28] 金慶超,沈娜,楊郁,等.spyl的DNA改組提高普那霉素的產(chǎn)量[J].中國抗生素雜志,2015,40(3):178-191.

[29] SUZUKI Y,ASADA K,MIYAZAKI J,et al.Enhancement of the latent 3-isopropylmalate dehydrogenase activity of promiscuous homoisocitrate dehydrogenase by directed evolution[J].Biochem J,2010,431(3):401-410.

[30] 黃磊.光滑假絲酵母酮酯還原酶的分子改造及應(yīng)用研究[D].上海:華東理工大學(xué),2014.

[31] MAKINO Y,ITOH N.Development of an improved phenylacetaldehyde reductase mutant by an efficient selection procedure[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014,98:4437-4443.

[32] 張航,陳曦,馮進(jìn)輝,等.高通量篩選具有催化活性和立體選擇性羰基還原酶[J].生物工程學(xué)報,2015,31(2):220-230.

[33] CHEN Z,ZENG A P.Protein design in systems metabolic engineering for industrial strain development[J].Biotechnol J,2013,8(5):523-533.

[34] URANO N,FUKUI S,KUMASHIRO S,et al.Directed evolution of an aminoalcohol dehydrogenase for efficient production of double chiral aminoalcohols[J].J Biosci Bioeng,2011,111(3):266-271.

[35] MOON J,LIU Z L.Engineered NADH-dependent GRE2 fromSaccharomycescerevisiaeby directed enzyme evolution enhances HMF reduction using additional cofactor NADPH[J].Enzyme Microb Technol,2012,50(2):115-120.

[36] ASAKO H,SHIMIZU M,ITOH N.Biocatalytic production of (S)-4-bromo-3-hydroxybutyrate and structurally related chemicals and their applications[J].Appl Microbiol Biotechnol,2009,84(3):397-405.

[37] 高秀珍.烯酮/烯酯還原酶和D-氨基酸脫氫酶的篩選、性質(zhì)及定向進(jìn)化[D].北京:中國科學(xué)院大學(xué),2013.

[38] 宮緒敏,聶堯,徐巖,等.羰基還原酶輔酶結(jié)合域位點突變對其不對稱催化性能的影響[J].催化學(xué)報,2012,33(2):330-335.

[39] ZHANG D L,CHEN X,CHI J,et al.Semi-rational engineering a carbonyl reductase for the enantioselective reduction ofβ-amino ketones[J].ACS Catal,2015,5(4):2452-2457.

[40] WANG N Q,SUN J,HUANG J.Cloning,expression,and directed evolution of carbonyl reductase fromLeifsoniaxyliHS0904 with enhanced catalytic efficiency[J].Appl Microbiol Biotechnol,2014,98:8591-8601.

[41] MA S K,GRUBER J,DAVIS C,et al.A green-by-design biocatalytic process for atorvastatin intermediate[J].Green Chem,2010,12:81-86.

[42] WIJMA H J,FLOOR R J,JANSSEN D B.Structure- and sequence-analysis inspired engineering of proteins for enhanced thermostability[J].Curr Opin Struct Biol,2013,23(4):588-594.

[43] 王曉玥,王白云,王智文,等.蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的研究進(jìn)展[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2015,42(2):123-131.

[44] SUN Z T,LONSDALE R,LLIE A,et al.Catalytic asymmetric reduction of difficult-to-reduce ketones:triple-code saturation mutagenesis of an alcohol dehydrogenase[J].ACS Catal,2016,6(3):1598-1605.

(責(zé)任編輯 荀志金)

Progress in molecular modification of microbial carbonyl reductase

CEN Jiashan1,GONG Tiantian1,CHEN Weiqing2,WANG Pu1

(1. College of Pharmaceutical Science,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China;2. College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang Shuren University,Hangzhou 310015,China)

Carbonyl reductase is widely used in the synthesis of chiral compounds due to its excellent stereoselectivity and catalytic activity.However,low expression level,difficult to purify intracellular enzyme,and unsatisfactory enzyme activity hammer industrial applications of native microbial carbonyl reductase.Using protein engineering techniques to modify carbonyl reductaseinvitrocould substantially improve its ability for asymmetric synthesis of chiral compounds.In this paper,we reviewed different molecular modification strategies,advances and achievements in molecular modificationinvitroof carbonyl reductase.The general rules in carbonyl reductase molecular modification process are also summarized.Future development in this field is also discussed.This review can provide useful reference for the study on microbial carbonyl reductase molecular modificationinvitro.

carbonyl reductase; catalysis mechanism; directed evolution; rational design

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.03.007

2017-02-27

國家自然科學(xué)基金(21676250)；浙江省自然科學(xué)基金(LY16B060010)

岑佳善(1991—)，女，浙江慈溪人，研究方向：生物催化與生物轉(zhuǎn)化;王 普(聯(lián)系人)，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:wangpu@zjut.edu.cn

Q78

A

1672-3678(2017)03-0036-06