同軸靜電紡RSF載VEGF納米纖維膜的制備與研究

1. 東華大學(xué)紡織面料技術(shù)教育部重點實驗室，東華大學(xué)紡織學(xué)院，上海 201620；2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海 200011

靜電紡技術(shù)利用外加電場使聚合物溶液或熔體帶電，在噴頭末端形成懸垂的錐狀液滴，當(dāng)液滴表面的電荷斥力超過其表面張力時，液滴表面會高速噴射出“射流”，經(jīng)過電場的拉伸細(xì)化及溶劑的揮發(fā)，纖維最終固化并沉積于接收板上，形成納米纖維[1]。同軸靜電紡技術(shù)由靜電紡技術(shù)發(fā)展而來，該技術(shù)不僅使制備的納米纖維膜具有孔隙率高、比表面積大、均一性好、可在納米尺度模仿天然細(xì)胞外基質(zhì)[2-3]等特點，并且可以在芯層搭載各種藥物，通過殼層的聚合物對芯層的藥物進(jìn)行保護(hù)[4-5]，以達(dá)到藥物緩慢釋放的效果。

再生絲素蛋白(regenerated silk fibroin，RSF)具有無毒、生物相容性良好及可降解等性能[6-7]，在生物醫(yī)用領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是由兩個相同多肽鏈通過二硫鍵構(gòu)成的同源二聚體糖蛋白，具備誘導(dǎo)血管再生的能力，而血管能為組織再生提供營養(yǎng)物質(zhì)[8]。利用同軸靜電紡技術(shù)，將RSF作為殼層包裹VEGF制成納米纖維膜，其不僅在結(jié)構(gòu)上模仿了天然細(xì)胞外基質(zhì)，具有孔隙率高、比表面積大等特點，而且芯層的VEGF得到了良好的保護(hù)，可用于組織工程修復(fù)，具有一定的醫(yī)用發(fā)展前景。

本文擬采用同軸靜電紡技術(shù)，將RSF溶液作為殼層，VEGF和胎牛血清作為芯層，在固定其他因素的情況下，通過改變芯層流速，制備不同殼芯結(jié)構(gòu)的同軸納米纖維膜(簡稱“納米纖維膜”)。然后采用掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)及ELISA試劑盒等手段，對納米纖維膜的纖維形態(tài)、纖維直徑及其不勻率、殼芯結(jié)構(gòu)、VEGF釋放性能等進(jìn)行對比分析。

1 試驗

1.1 試驗原料和試驗儀器

桑蠶繭(江蘇徐州產(chǎn)，簡稱“蠶繭”)；VEGF(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)；胎牛血清(賽默飛世爾科技有限公司)；尿素(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；溴化鋰(純度99%，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)；甲酸(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；去離子水；透析袋(截留相對分子質(zhì)量14 000，上海雷布斯網(wǎng)絡(luò)科技有限公司)；醫(yī)用一次性注射針管(5.0 mL，市售)；移液器(大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司)；ELISA試劑盒(武漢塞維爾生物科技有限公司)；PBS磷酸緩沖溶液(上海元象科技有限公司)。

FA2004 電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)；SHJ-6A 磁力攪拌水浴鍋(常州迅生儀器有限公司)；DHG-9145A 電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)；LGJ-10 真空冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；KDS100注射泵(美國KD Scientific 公司)；DW-P303-AADCD1高壓直流電源[東文高壓電源(天津)有限公司]；TM-3000臺式掃描電子顯微鏡(日本日立高科技有限公司)；JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；SynergyH1酶標(biāo)檢測儀(美國寶特儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 絲素蛋白的提取[9]

(1) 脫膠。將5 g蠶繭剪碎并浸沒于150.0 mL濃度為8.0 mol/L的尿素溶液中，90 ℃水浴3 h后取出脫膠蠶繭，用去離子水洗凈、烘干。重復(fù)該步驟3次，得到絲素蛋白。

(2) 溶解。將絲素蛋白經(jīng)60 ℃水浴溶解于30.0 mL 濃度為9.3 mol/L的溴化鋰溶液中，待冷卻后用紗布過濾，去除未溶解的雜質(zhì)，得到絲素蛋白溶液。

(3) 透析。把經(jīng)過前處理的透析袋徹底洗凈，將絲素蛋白溶液裝入透析袋，用去離子水透析48 h，前12 h內(nèi)每間隔4 h更換一次去離子水，之后每間隔8 h更換一次去離子水。

(4) 凍干。將經(jīng)過透析的絲素蛋白溶液冷凍干燥，得到RSF。

和逍遙子（張勇）以及他的年輕團隊比起來，我確實有些不一樣的東西，比如有創(chuàng)始人的光環(huán)，有自己的闡釋問題、運營管理的方式方法。但是，他們身上的東西我也沒有，比如知識結(jié)構(gòu)的全面性、系統(tǒng)性。

1.2.2 納米纖維膜的制備

將RSF溶于甲酸中，配置成濃度為14 g/mL的RSF溶液作為殼層。在室溫下攪拌24 h，待RSF完全溶解后靜置、脫泡，然后裝入一支一次性醫(yī)用注射針管(5.0 mL)。同時，將胎牛血清作為芯層裝入另外一支一次性醫(yī)用注射針管(5.0 mL)。將兩支針管分別置于兩個注射泵上并連接至同軸針頭。在室溫下進(jìn)行靜電紡，采用包有鋁箔的接地金屬板接收納米纖維膜。同軸靜電紡裝置如圖1所示。

圖1 同軸靜電紡裝置示意[10]

1.2.3 纖維形態(tài)觀察與直徑測量

將納米纖維膜裁成0.3 cm×0.3 cm并貼于導(dǎo)電膠上進(jìn)行噴金處理，通過TM-3000日立臺式掃描電子顯微鏡觀察纖維形態(tài)。同時使用Image J軟件，隨機選取50根纖維測量直徑，并計算纖維直徑不勻率。

1.2.4 纖維殼芯結(jié)構(gòu)觀察

將TEM專用銅網(wǎng)置于鋁箔上收集納米纖維，真空干燥后，通過JEM-2100透射電子顯微鏡觀察纖維殼芯結(jié)構(gòu)。

1.2.5 納米纖維膜VEGF釋放測試

裁取尺寸為1.5 cm×1.5 cm的納米纖維膜放入1.0 mL磷酸緩沖溶液(PBS)中，置于37 ℃搖床上進(jìn)行VEGF釋放試驗。每隔24 h用移液槍取出0.5 mL PBS(作為“樣品液”)，并加入0.5 mL新鮮PBS，使PBS的容積維持在1.0 mL。將樣品液做好標(biāo)記，然后凍存于-80 ℃條件下待測。使用ELISA試劑盒測試各個時間點取出的樣品液的吸光度。依據(jù)VEGF標(biāo)準(zhǔn)釋放曲線(根據(jù)已知VEGF濃度所測定的PBS溶液的吸光度，再通過擬合得到的VEGF濃度-吸光度關(guān)系曲線)，可以計算出各個吸光度所對應(yīng)的樣品液中的VEGF濃度，通過進(jìn)一步計算得到各樣品液中的VEGF含量并將其累積，得到VEGF累積釋放量，最后利用Origin軟件處理，得到VEGF累積釋放量與釋放時間的關(guān)系曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 芯層流速對纖維形態(tài)的影響

本課題組通過前期對RSF靜電紡的研究得知，采用RSF溶液進(jìn)行靜電紡絲，當(dāng)溶液濃度為14 g/mL時，設(shè)置紡絲電壓為17 kV、流速為0.80 mL/h、收集距離為17.0 cm，可以獲得形態(tài)規(guī)整的納米纖維。因此，本文采用相同的紡絲電壓(17 kV)和收集距離(17.0 cm)，殼層流速采用0.80 mL/h 并保持不變，殼層為14 g/mL的RSF溶液，芯層為胎牛血清，改變芯層流速(0.60、0.40、0.30、0.15、0.10、0.05 mL/h)進(jìn)行同軸靜電紡試驗，制備納米纖維膜。圖2所示為不同芯層流速下制備的納米纖維膜的掃描電鏡照片(放大倍數(shù)3 000)。表1給出了不同芯層流速下制備的納米纖維膜中的纖維直徑及其不勻率(CV值)。

(a) 0.60 mL/h

(b) 0.40 mL/h

(c) 0.30 mL/h

(d) 0.15 mL/h

(e) 0.10 mL/h

(f) 0.05 mL/h

芯層流速/(mL·h-1)纖維直徑平均值/nmCV值0.601 0240.1390.408100.1330.307120.1350.156740.2800.106490.3080.055990.205

從圖2可以明顯看出，當(dāng)芯層流速為0.60 mL/h時，掃描電鏡照片中的纖維數(shù)量較少，且纖維呈扁平帶狀。在紡絲過程中，也發(fā)現(xiàn)當(dāng)芯層流速設(shè)置為0.60 mL/h時，紡絲效率極低且鋁箔上有類似水滴狀的芯層溶液。芯層流速較大，一方面會加大殼層和芯層產(chǎn)生互溶的可能性，另一方面會使殼層對芯層的包裹效果變差，如殼層很薄或未能完全包裹芯層，因而所制備的纖維在外界因素如空氣的壓迫下形成扁平帶狀，而且不具備成纖性的芯層脫離殼層的包裹會直接噴射到鋁箔上成為水滴狀。隨著芯層流速從0.60 mL/h減小至0.05 mL/h，纖維形態(tài)從較粗的扁平帶狀逐漸向圓柱形轉(zhuǎn)變，當(dāng)芯層流速為0.30 mL/h時幾乎看不到扁平帶狀纖維。

結(jié)合表1中的數(shù)據(jù)可以得出，隨著芯層流速逐步降低，纖維的平均直徑逐漸減小。在芯層流速為0.60、0.40 mL/h這兩種情況下，纖維直徑的CV值較低，但紡絲效率較差。因此，本文選取芯層流速0.30、0.15、0.10、0.05 mL/h進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.2 芯層流速對纖維殼芯結(jié)構(gòu)的影響

在固定殼層(即RSF溶液)濃度14 g/mL、芯層為胎牛血清、紡絲電壓17 kV、殼層流速0.80 mL/h、接收距離17.0 cm的條件下，改變芯層流速(0.30、0.15、0.10、0.05 mL/h)進(jìn)行同軸靜電紡試驗，制備的納米纖維透射電鏡照片如圖2所示。

(a) 0.30 mL/h

(b) 0.15 mL/h

(c) 0.10 mL/h

(d) 0.05 mL/h

如圖2所示，4個芯層流速下獲得的納米纖維均呈現(xiàn)殼芯結(jié)構(gòu)，可用于后續(xù)載VEGF試驗。當(dāng)芯層流速為0.30 mL/h時，雖然可看出纖維具備殼芯結(jié)構(gòu)，但殼層非常薄，而且在觀察過程中部分纖維未見殼芯結(jié)構(gòu)。這說明芯層流速為0.30 mL/h時所制備的纖維，其掃描電鏡照片雖未顯示纖維形態(tài)有明顯異常，但此時獲得具有殼芯結(jié)構(gòu)的纖維的效率較低，殼層對芯層的包覆不是很理想。對比圖2中(a)～(d)可以發(fā)現(xiàn)，隨著芯層流速逐漸減小，纖維殼芯結(jié)構(gòu)逐漸清晰且較穩(wěn)定，同時纖維的直徑呈下降趨勢，這與“2.1”節(jié)的測量結(jié)果一致。

結(jié)合“2.1”節(jié)測得的纖維平均直徑及CV值可知，當(dāng)芯層流速為0.05 mL/h時，纖維的平均直徑最小且CV值較低；當(dāng)芯層流速為0.15、0.10 mL/h時，纖維的平均直徑較接近，但前者得到的纖維的CV值更低，這表明纖維的均勻性更好。因而，本文選取芯層流速為0.15、0.05 mL/h進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.3 同軸靜電紡RSF載VEGF納米纖維膜的釋放性能分析

基于以上試驗，在紡絲電壓(17 kV)、殼層流速(0.80 mL/h)、接收距離(17.0 cm)保持不變的條件下，改變芯層流速(0.15、0.05 mL/h)進(jìn)行同軸靜電紡。其中，殼層為14 g/mL的RSF溶液，芯層為VEGF和胎牛血清的混合溶液，VEGF的濃度為5 μg/mL。圖3所示為不同芯層流速下制備的納米纖維膜的VEGF釋放曲線。

(a) 0.15 mL/h

(b) 0.05 mL/h

從圖3可以看出，兩個芯層流速下制得的納米纖維膜的VEGF釋放曲線總體均呈上升趨勢，表明同軸靜電紡可以實現(xiàn)RSF包裹VEGF及VEGF緩慢釋放。對比圖3(a)和(b)可以發(fā)現(xiàn)，第2天時，芯層流速為0.15 mL/h時所制備的納米纖維膜的VEGF累積釋放量達(dá)到420 pg，而芯層流速為0.05 mL/h時所制備的納米纖維膜的VEGF累積釋放量為86pg。芯層流速為0.05 mL/h時所制備的納米纖維膜，其納米纖維的芯層厚度較小，VEGF的含量相應(yīng)較少，因此VEGF累積釋放量明顯低于芯層流速為0.15 mL/h時。第2天到第10天期間，芯層流速為0.15 mL/h時所制備的納米纖維膜，第4天的VEGF累積釋放量為304 pg，比第2天下降了約27.6%，第10天的VEGF累積釋放量為389 pg；芯層流速為0.05 mL/h 時所制備的納米纖維膜，VEGF累積釋放量呈持續(xù)上升趨勢，第10天的VEGF累積釋放量為194 pg。對其原因進(jìn)行分析：芯層流速為0.15 mL/h時，雖然透射電鏡照片顯示纖維具有明顯的殼芯結(jié)構(gòu)，但由于芯層流速較快，并非所有芯層的VEGF都被RSF完好地包裹，可能有部分芯層突破殼層的包裹直接暴露在纖維表面，這使得第2天檢測得到的VEGF累積釋放量不僅包括芯層緩慢釋放的VEGF，還包括暴露在纖維表面的VEGF，因此測試結(jié)果偏大；此外，RSF屬于親水性材料[11]，將納米纖維膜置于PBS中進(jìn)行緩釋試驗，由RSF制成的納米纖維膜浸潤性較好，芯層流速為0.15 mL/h時，納米纖維的芯層厚而殼層較薄，芯層中的VEGF更容易且更快地釋放。

綜上，芯層流速為0.05 mL/h時，纖維的殼芯結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，而且能夠達(dá)到較好的VEGF緩慢釋放效果。

3 結(jié)論

(1) 在固定殼層溶液(即RSF)濃度14 g/mL、紡絲電壓17 kV、接收距離17.0 cm、殼層流速0.80 mL/h的條件下，隨著芯層流速從0.60 mL/h減小至0.05 mL/h，納米纖維由扁平帶狀逐漸向圓柱形轉(zhuǎn)變，且纖維的平均直徑逐漸減小。芯層流速過高會引起紡絲過程不穩(wěn)定，且紡絲效率較低。當(dāng)芯層流速為0.30、0.15、0.10、0.05 mL/h時，紡絲過程較穩(wěn)定，且纖維形態(tài)良好。

(2) 在其他條件相同的情況下，隨著芯層流速減小，纖維的殼芯結(jié)構(gòu)中，芯層厚度減小。當(dāng)芯層流速為0.15、0.05 mL/h時，纖維具有明顯的殼芯結(jié)構(gòu)，且纖維的均勻性較好。

(3) 同軸靜電紡RSF載VEGF納米纖維膜具備緩慢釋放VEGF的能力。芯層流速為0.15 mL/h時，納米纖維膜上負(fù)載的VEGF含量較大，相應(yīng)的VEGF累積釋放量更多，但易導(dǎo)致纖維的殼芯結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。芯層流速為0.05 mL/h時，纖維的殼芯結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定，而且VEGF釋放性能良好。