禽源大腸桿菌的耐藥性分析及β-內(nèi)酰胺類耐藥基因的檢測

余 蕊,馬文杰,高 尚,張清一,鞠輝明,楊躍飛,王彥紅

(1.揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇 揚州 225009;2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心江蘇省人獸共患病學重點實驗室,江蘇 揚州 225009)

大腸桿菌是臨床上細菌性疾病的常見病原,具有較高的發(fā)病率和死亡率,給畜牧業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。因其復(fù)雜的血清型,導(dǎo)致現(xiàn)在還沒有確切的疫苗可以對大腸桿菌病進行預(yù)防,目前主要靠抗菌藥物對該病進行控制。隨著β-內(nèi)酰胺類的抗菌藥在養(yǎng)殖業(yè)的廣泛應(yīng)用,耐藥菌株的出現(xiàn)頻率也在逐年增長,β-內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生是細菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要機制[1]。根據(jù)基因型的不同,可以將 β-內(nèi)酰胺酶大致分為 SHV、TEM、CTX-M、OXA和其他型5種型,其中CTX-M型根據(jù)基因序列同源性大于95%被分為5個組群,分別為CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-8群、CTX-M-9群、CTX-M-25群。CTX-M-1群有：CTX-M-1、CTX-M-3、CTX-M-79,等;CTX-M-2 群有 CTX-M-2、CTX-M-4、CTXM-4L,等;CTX-M-9 群有 CTX-M-9、CTXM-14、CTX-M-125,等。隨著抗菌藥不斷地更新?lián)Q代,CTX-M型的β-內(nèi)酰胺酶的氨基酸殘基不斷發(fā)生突變,直接影響著酶對抗生素的耐藥性[3]。為了解大腸桿菌的耐藥情況及β-內(nèi)酰胺酶的基因型分布現(xiàn)狀,我們對5月份門診送檢病科進行了大腸桿菌分離、藥敏試驗和SHV、TEM、CTX-M-1群、CTX-M-2群、CTX-M-9群基因檢測。

1 材料與方法

1.1 病例來源 采集2017年5月?lián)P州大學動物醫(yī)院畜禽門診送檢病例,這些病例氣囊炎、心包炎、肝周炎等病變特征。

1.2 藥品與試劑 藥敏紙片,TaKaRa LA Taq酶,dNTP Mixture,10X LA PCR BufferⅡ(Mg2+plus),100 bp DNA Ladder,Super GelRed 10 000 Xin Water,10x Ladder Buffer。

1.3 細菌分離 采集的病料接種于麥康凱培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h,挑選單個菌落接種于麥康凱培養(yǎng)基上純化,并進行生化鑒定。

1.4 藥敏試驗 采用紙片法分別確認50株分離菌對于復(fù)方新諾明、氯霉素、氟苯尼考、鏈霉素、新霉素、諾氟沙星、慶大霉素、丁胺卡那霉素、頭孢曲松、多西環(huán)素、左氧氟沙星、多黏菌素、妥布霉素、美洛西林、卡那霉素15種藥物的耐藥情況。

1.5 DNA模板的制備 采用煮沸法制備細菌模板,將細菌無菌放置于事先高壓滅菌的裝有超純水的指形管中,指形管放入沸水中加熱8～10 min,-20℃保存。

1.6 PCR擴增耐藥基因 根據(jù)參考文獻[3],在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物(表1)。DNA模板預(yù)變性95℃加熱5 min,其中94℃變性1 min,退火溫度加熱1 min,72℃延伸1 min,32次循環(huán),最后72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳,觀察結(jié)果。出現(xiàn)預(yù)期大小的擴增產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序,比較分析,判斷產(chǎn)物具體的基因型。

表1 PCR擴增引物

2 結(jié)果

2.1 細菌分離 2017年5月份病料在麥康凱培養(yǎng)基上生長呈粉紅色,并進行生化鑒定,共分離鑒定出50株大腸桿菌。

2.2 藥敏試驗 50株分離菌對復(fù)方新諾明、氟苯尼考、多西環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素的耐藥率較高,其中對復(fù)方新諾明的耐藥率高達82%,對常用藥氟苯尼考和多西環(huán)素的耐藥率分別為60%和64%,β-內(nèi)酰胺類的抗生素美洛西林和頭孢曲松的耐藥率較低,分別為26%和20%。菌株的耐藥情況見表2。

表2 50株分離菌株的耐藥情況

2.3 PCR 檢測 TEM、CTX-M-1、CTX-M-2 和CTX-M-9和SHV 5種基因50株分離菌經(jīng)PCR擴增后均未檢測到SHV型及CTX-M-2群基因。PCR擴增TEM型基因,出現(xiàn)約900 bp的條帶,與預(yù)期大小833 bp相近(見圖1),將樣品測序結(jié)果上傳GenBank,Blast所測基因。50株大腸桿菌有23株檢測到此基因。此外,PCR擴增CTX-M-1型和CTX-M-9型,出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶833 bp(見圖2)和863 bp(見圖3),將樣品測序結(jié)果上傳Gen-Bank,Blast后2株細菌的CTX-M-1型陽性產(chǎn)物序列均為CTX-M-79,5株細菌的CTX-M-9型分別為4株CTX-M-14,1株CTX-M-125。根據(jù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)有3株細菌含有至少含有2種β-內(nèi)酰胺類耐藥基因,其中2株含有CTX-M-79的菌株均含有TEM基因(見表3)。

圖1 TEM型基因PCR檢測結(jié)果

圖2 CTX-M-1型基因電泳結(jié)果

圖3 CTX-M-9型基因電泳結(jié)果

表3 基因檢測陽性結(jié)果

3 討論

從本試驗的結(jié)果可以看出,臨床分離出的菌株對于磺胺類藥物耐藥性相當高,其中對復(fù)方新諾明的耐藥率甚至高達82%,對β-內(nèi)酰胺類抗生素—美洛西林及頭孢曲松的耐藥率也較高。耐藥菌株出現(xiàn)的概率如此之高,其原因有很多種,主要是食用動物的飼養(yǎng)中抗生素的濫用。近幾年來我國流行的β內(nèi)酰胺酶耐藥基因的種類主要是SHV、TEM、CTX-M型[4]。已有的文獻中動物源性大腸桿菌SHV的檢測為37.7%[5],而在2017年蘭芳俊等研究中發(fā)現(xiàn)人類醫(yī)院中存在的大腸桿菌未檢測出SHV型[6],同樣,在本研究的50株禽源大腸桿菌未發(fā)現(xiàn)SHV型。TEM是主要流行β內(nèi)酰胺酶耐藥基因,此基因在50株禽源大腸桿菌的檢測率為46%(23/50),與近幾年的研究結(jié)果相一致[5、7]。

大腸桿菌中常存在CTX-M型,并且經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)不同組群的CTX-M型對不同抗生素的耐藥效果存在顯著的差異[2、8-10]。而出現(xiàn)變化的在于具體的基因亞型,近年來中國地區(qū)流行的主要是CTXM-14、CTX-M-15 和 CTX-M-55[2、11],而在本研究中,2017年5月份從揚州及周邊地區(qū)所分離的禽源大腸桿菌未檢測CTX-M-15及CTX-M-55,主要出現(xiàn)的是CTX-M-14和CTX-M-79,還出現(xiàn)少量CTX-M-125。此外,根據(jù)CTX-M型檢測結(jié)果和蘭芳俊的研究結(jié)果相類似,均檢出CTXM-1型和CTX-M-9型,而未檢出CTX-M-2 型[6]。

抗生素耐藥性中存在的巨大時間和地域差異可能是因為在生產(chǎn)實踐和臨床治療中,可能是由于不同的醫(yī)生、不同時期及不同地區(qū)使用抗生素種類及劑量的差異所導(dǎo)致的。細菌高耐藥性的現(xiàn)狀提示我們,在藥物的合理使用方面還存在欠缺,在臨床用藥時,我們可以根據(jù)藥敏試驗結(jié)果,合理選擇抗生素,不可長期大量使用同一種抗生素,避免耐藥細菌特別是超級細菌的大量出現(xiàn)。