基于C602菌株的羊腸毒血癥自制滅活疫苗本動物免疫試驗

李生慶,范玉霞,李志寧,劉懷新,扎 西,李積良

(1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧 810016;2.青海省祁連縣野牛溝鄉(xiāng)獸醫(yī)站,青海 祁連 810400)

產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠產(chǎn)生多種外毒素,目前已發(fā)現(xiàn)的外毒素達(dá) 12種,其中 α、β、ε、ι為主要致死性毒素也是分型毒素,根據(jù)這4種毒素,產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A～E 5個亞型[1],其中D型產(chǎn)氣莢膜梭菌嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè),其引起的疾病為羊腸毒血癥,該病潛伏期短、發(fā)病快、死亡快[2]。

青海地處青藏高原,是我國重要的牧區(qū)之一,綿羊養(yǎng)殖業(yè)在青海牧區(qū)養(yǎng)殖業(yè)中所占比重較大,鑒于產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病特點,該菌對青海省養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成一定程度的威脅。據(jù)青海省海北州祁連縣2007-2010年綿羊發(fā)病死亡情況調(diào)查,平均3.9%的發(fā)病死亡率中,該病的致死率達(dá)到1.7%,接近綿羊發(fā)病死亡的50%,戶均死亡達(dá)到3.6只,經(jīng)濟(jì)損失在1 500元左右。若按全縣60萬只的飼養(yǎng)量計算,僅該疾病死亡的經(jīng)濟(jì)損失每年高達(dá)300～500萬元。

在我國,多年來曾先后研制了滅活單菌苗、多聯(lián)菌苗預(yù)防D型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的腸毒血癥,取得了一定的防控效果,但D型產(chǎn)氣莢膜梭菌病仍時有發(fā)生[3]。鑒于此,本實驗室在提高C602產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株產(chǎn)毒能力的基礎(chǔ)上,研制了羊腸毒血癥氫氧化鋁單價疫苗,并以不同毒價、不同免疫劑量的鋁苗為試驗組、以市售四聯(lián)苗作為對照組,分別同時免疫綿羊,檢測了自制疫苗的綿羊免疫效果,根據(jù)試驗查明,困擾我省羊四聯(lián)苗免疫綿羊急性死亡的原因是由于現(xiàn)用疫苗免疫期較短,不能完全控制該病的發(fā)生導(dǎo)致的。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 本試驗所用羊只由青海省海北州祁連縣野牛溝鄉(xiāng)一養(yǎng)殖戶提供,羊群未進(jìn)行四聯(lián)苗免疫,體重15～18 kg之間,體況良好。

1.2 藥品 羊腸毒血癥自制鋁苗(批號：201501、201502青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院高原動物疫病診斷與防治實驗室研制);羊四聯(lián)苗,購自青海省生物制品廠。

1.3 羊只免疫 試驗共分為6組,A組：1.5萬MLD/mL(小鼠靜脈注射)0.5 mL免疫組,B組：1.5萬MLD/mL(小鼠靜脈注射)2 mL免疫組,C組：1.0萬MLD/mL(小鼠靜脈注射)0.5 mL免疫組、D組：1.0萬MLD/mL(小鼠靜脈注射)2.0 mL免疫組、E組：羊四聯(lián)苗1.0 mL免疫組、F組：空白對照組(見中插彩版圖1)。

每組按相應(yīng)劑量免疫羊10只,免疫前按組別對羊只進(jìn)行耳標(biāo)編號,并用藍(lán)、紅兩種顏色的自噴漆分別在頭、頸、背進(jìn)行標(biāo)記,并在每次采集血清時補(bǔ)噴1次,直至試驗結(jié)束。標(biāo)記后,按組別以不同劑量進(jìn)行疫苗注射免疫。具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 免疫羊組別設(shè)置

1.4 血清采集 上述免疫羊只于免疫后1、2、3、4、6、9個月按組別頸靜脈采血3～5 mL,在4℃冰箱過夜,待血清析出后,按組別吸出血清待用。

1.5 中和毒素制備 將C602菌株在自制VF培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)16 h,收集菌液于離心管中,按1∶1加入含2.5 g/L胰酶的1%Na2CO3溶液,活化后離心吸取上清,用體重18～20 g小鼠靜脈注射測定毒價,待用。

1.6 中和試驗 將上述毒素抗原遞增稀釋到相應(yīng)滴度,不同毒素含量分配到不同的稀釋管中1 mL,每管加入血清0.5 mL,37℃作用50 min后,每組0.3 mL分別靜脈注射小鼠2只,觀察、記錄死亡情 況(見表2)。

表2 中和試驗稀釋注射

2 結(jié)論

2.1 C602腸毒血癥自制苗相同毒力、不同免疫劑量血清效價測定結(jié)果 從試驗數(shù)據(jù)可知,不論是1.5萬MLD/mL毒價,還是1.0萬MLD/mL的自制苗,不同免疫劑量免疫羊只后,其產(chǎn)生的血清抗體存在明顯差異,大劑量免疫組其免疫水平明顯高于低劑量免疫組(見表3)。

2.2 C602腸毒血癥自制苗不同毒力、同一免疫劑量血清效價測定結(jié)果 從試驗數(shù)據(jù)可知,相同免疫劑量,而疫苗的抗原量不同,其免疫效果存在明顯差異。抗原量較高的疫苗免疫羊只后產(chǎn)生的抗體明顯高于抗原量較低的疫苗,且疫苗的保護(hù)期較長。

2.3 羊四聯(lián)苗免疫效果 本次試驗中以現(xiàn)用四聯(lián)苗作為對照,試驗結(jié)果表明,該疫苗的保護(hù)期為2個月。

3 討論

3.1 相同佐劑條件下,疫苗免疫效果與毒素含量呈正比,毒素含量越高,疫苗效果越好[4]。本次試驗中我們利用D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株C602,結(jié)合本實驗室自制的產(chǎn)毒培養(yǎng)基,得到產(chǎn)毒為1.5萬MLD/mL毒價和1.0萬MLD/mL毒價的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)液,并制備氫氧化鋁單價疫苗,免疫羊只后產(chǎn)生了良好的免疫保護(hù)效果。前者免疫羊只2 mL,免疫9個月后,其血清抗體仍可中和6 MLD的毒素。后者免疫6個月后仍可中和6 MLD的毒素,其結(jié)果與文獻(xiàn)報道相一致。

3.2 按照《中華人民共和國生物制品規(guī)程》[5]要求,D型產(chǎn)氣莢膜梭菌氫氧化鋁類毒素疫苗免疫羊只21 d后,其血清抗體能中和3 MLD毒素即為合格,本次試驗所研制的疫苗,不同劑量免疫均達(dá)到其要求。但免疫期長短在各組別之間存在明顯差異,其中1.5萬MLD/mL毒價免疫2 mL組的免疫期最長,免疫9個月血清抗體仍可中和6 MLD毒素抗原,而1.0萬MLD/mL毒價疫苗0.5 mL免疫組免疫6個月后血清抗體只能中和3個MLD毒素抗原,羊四聯(lián)苗1 mL對照免疫組,其免疫保護(hù)期僅為2個月。我們利用已知道疫苗在該地區(qū)進(jìn)行羊只免疫,基本控制了該病在該地區(qū)的繼續(xù)發(fā)生,因此,經(jīng)上述對比試驗發(fā)現(xiàn),青海省祁連地區(qū)羊腸毒血癥的發(fā)生于先用疫苗的免疫保護(hù)期較短有直接關(guān)系。

表3 免疫綿羊血清抗體測定結(jié)果