食品微生物沙門菌的檢測(cè)

◎ 孫 蕾

（山東恒誠(chéng)檢測(cè)科技有限公司，山東 萊州 261400）

1 檢驗(yàn)沙門菌的原因

在食品中毒事件中，由細(xì)菌引發(fā)的疾病約占65%，而細(xì)菌中由沙門菌引起的食物中毒居于首位。資料顯示，在引起沙門菌中毒的食品中，肉類等動(dòng)物性產(chǎn)品占到90%以上。因動(dòng)物性產(chǎn)品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，非常利于沙門菌的生長(zhǎng)繁殖，如果攝入含有大量沙門菌的動(dòng)物性產(chǎn)品，就會(huì)引發(fā)細(xì)菌性感染，進(jìn)而在毒素的作用下發(fā)生食物中毒。此外，沙門菌還有部分菌種在自然環(huán)境中發(fā)生變異，產(chǎn)生了類似耐藥性的海德堡沙門菌。

2 沙門菌的傳播媒介

2.1 肉及肉制品

據(jù)統(tǒng)計(jì)，肉及其制品中沙門菌檢出率：中國(guó)最高，為1.1%～39.5%；其次為美國(guó)，檢出率為20%～25%；第三為日本，檢出率為10.3%；第四為英國(guó)，檢出率為9.9%。

2.2 蛋及蛋制品

目前，國(guó)內(nèi)蛋及其制品沙門菌檢出率為3.9%～43.7%，近年來(lái)由于蛋類污染造成細(xì)菌感染人數(shù)呈上升趨勢(shì)。

2.3 加工、運(yùn)輸、銷售環(huán)境

在加工、運(yùn)輸、出售過(guò)程中，食品也容易被沙門菌污染。因?yàn)椋抽T菌在糞便、土壤、食品、水中可存活長(zhǎng)達(dá)2年之久。

2.4 人為因素

人也可以作為沙門菌的傳染載體。例如，國(guó)外有個(gè)廚師感染了沙門菌后傳染了很多人。沙門菌是在人的病灶中生存，但是作為載體的人自己是沒(méi)有感覺(jué)的。另外，在恢復(fù)期的患者和無(wú)癥狀的帶菌者也可能成為常見(jiàn)的傳染源。

3 沙門菌感染的臨床表現(xiàn)

沙門菌感染主要表現(xiàn)形式有3種：胃腸型、傷寒型、敗血癥型。①胃腸炎型特點(diǎn)：起病急驟，伴有發(fā)熱癥狀，體溫一般在38～39 ℃，常伴有惡心、嘔吐，腹痛，腹瀉。②傷寒型特點(diǎn)：或有發(fā)熱癥狀，亦可有相對(duì)緩脈，常見(jiàn)腹瀉。③敗血癥型特點(diǎn)：多見(jiàn)于患有慢性疾病的成人、嬰幼兒、兒童等。起病急驟，有畏寒、發(fā)熱、出汗及輕重不等的胃腸道癥狀。

4 檢驗(yàn)沙門菌的實(shí)驗(yàn)室要求

檢驗(yàn)沙門菌的實(shí)驗(yàn)室要求是二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室及二級(jí)生物安全柜（在負(fù)壓的情況下防止致病微生物的氣溶膠飄離實(shí)驗(yàn)室對(duì)人員及環(huán)境造成污染）。

5 沙門菌的常規(guī)檢驗(yàn)方法

沙門菌大?。?.6～1.0）μm×（2～3）μm，無(wú)芽孢，一般有鞭毛（雞沙門菌除外），無(wú)莢膜，多數(shù)有菌毛，革蘭氏陰性桿菌，需氧或兼性厭氧，最適生長(zhǎng)溫度為35～37 ℃，最適pH值為6.8～7.8。目前，至少有67種O抗原和2 000個(gè)以上血清型，所致疾病稱沙門菌病。沙門菌常用生化檢測(cè)方法有三糖鐵（TSI），尿素酶試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)，VP試驗(yàn)、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)、丙二酸鹽試驗(yàn)和ONPG試驗(yàn)。

6 國(guó)內(nèi)外沙門菌檢測(cè)方法對(duì)比。

國(guó)內(nèi)常用檢測(cè)方法：國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

國(guó)外常見(jiàn)檢測(cè)方法：FDA（Food & Drug Administration），AOAC（Association of Official Analytical Chemists），F(xiàn)SIS（FOOD SAFETY AND INSPECTION SERVICE），ISO。

7 沙門菌的快速檢驗(yàn)手段

目前，沙門菌的快速檢驗(yàn)手段主要分為PCR技術(shù)和LAMP技術(shù)兩大類。①PCR技術(shù)中，熒光定量PCR技術(shù)靈敏度高、特異性好，是目前微生物檢測(cè)最精準(zhǔn)的方法。但缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，對(duì)所用儀器和操作人員要求高，不適合基層使用或現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。②LAMP技術(shù)，即環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，此方法的優(yōu)點(diǎn)除了特異性高、靈敏度高之外，與PCR技術(shù)相比，操作簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求低，結(jié)果呈現(xiàn)簡(jiǎn)單，可通過(guò)肉眼觀察是否渾濁或熒光反應(yīng)來(lái)進(jìn)行判斷，簡(jiǎn)單快捷，極其適合基層使用。下面著重就LAMP的一些情況作簡(jiǎn)單說(shuō)明。

7.1 LAMP技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

LAMP方法的優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，只需將反應(yīng)液、酶、引物和模板定量加入PCR管中；靈敏度高（比熒光PCR方法高2～5個(gè)數(shù)量級(jí)）；反應(yīng)時(shí)間短（1 h內(nèi)完成反應(yīng)）；不需使用特殊儀器，通過(guò)肉眼觀察反應(yīng)管是否變?yōu)榘咨珳啙峋湍芘袛嘟Y(jié)果。

LAMP方法的缺點(diǎn)：密封不好，易形成氣溶膠污染，加之目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室水平參差不齊，不能嚴(yán)格區(qū)分假陽(yáng)性反應(yīng)，建議在快檢試劑盒使用時(shí)采用實(shí)時(shí)渾濁儀；同時(shí)，對(duì)引物設(shè)計(jì)要求比較高，某些基因檢測(cè)并不適合該方法。

7.2 目前國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室同類檢測(cè)設(shè)配使用情況

目前，國(guó)內(nèi)基因診斷常采用PCR方法，涉及PCR儀，該儀器價(jià)格國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口價(jià)格不一，便宜的2萬(wàn)～3萬(wàn)也能買到，貴的20多萬(wàn)。條件比較好的實(shí)驗(yàn)室和國(guó)家機(jī)構(gòu)也有采用熒光定量PCR方法的，但儀器價(jià)格較高，一臺(tái)熒光定量PCR儀的價(jià)格在20萬(wàn)以上。

LAMP產(chǎn)品在臨床診斷中是不需要特殊儀器的，但臨床使用的成品試劑盒有賴于和國(guó)內(nèi)擁有毒株的老師合作開(kāi)發(fā)針對(duì)中國(guó)國(guó)情的疾病LAMP引物，在研發(fā)過(guò)程中由于涉及引物的選擇，引物濃度的調(diào)整，及反應(yīng)溫度和時(shí)間的優(yōu)化，需要用一種量化的方式去幫助研究者分析選擇數(shù)據(jù)，推薦使用實(shí)時(shí)基因擴(kuò)增儀。

8 沙門菌的存活力

在潮濕的環(huán)境中，沙門菌的存活率更高，干燥環(huán)境中存活率低，但最近國(guó)外科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌表面附著的生物膜會(huì)對(duì)沙門菌形成一種保護(hù)性外膜，這會(huì)對(duì)沙門菌存活起到保護(hù)作用，所以沙門菌的存活力比想象中更為強(qiáng)大，具有生物保護(hù)膜的沙門菌在干燥環(huán)境中存活力大為增強(qiáng)，之前認(rèn)為在堅(jiān)果、谷物、香料、奶粉和寵物食品等干性食品不可能存在該菌種的食品中也發(fā)現(xiàn)了沙門菌污染，它們能夠在長(zhǎng)期存放環(huán)境中生存下來(lái)，所以要強(qiáng)調(diào)更好的衛(wèi)生條件，研究更新的應(yīng)對(duì)策略。

9 沙門菌檢測(cè)中需要注意的問(wèn)題

沙門菌檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)為GB4789.4-2010《食品衛(wèi)生學(xué)微生物檢驗(yàn) 沙門菌檢驗(yàn)》。

檢測(cè)中出現(xiàn)的主要問(wèn)題為培養(yǎng)基和顯色瓊脂的選擇。沙門菌的種類比較多，為了防止漏檢，一般是強(qiáng)選擇性的培養(yǎng)基搭配選擇性弱一點(diǎn)的培養(yǎng)基，國(guó)標(biāo)里面的TTB比SC選擇性要強(qiáng)，BS也比XLD的選擇性強(qiáng)；SC更適合傷寒沙門菌和甲型副傷寒沙門菌增菌，最適增菌溫度為36 ℃，TTB更適合其他沙門菌增菌，最適增菌溫度為42 ℃，因?yàn)樯抽T菌有2 000多個(gè)菌型，一種增菌液不可能適合所有的沙門菌生長(zhǎng)，因此沙門菌增菌要同時(shí)用兩種培養(yǎng)基增菌。而沙門菌顯色培養(yǎng)基主要用于快速篩選、分離沙門菌。其基本原理：利用沙門菌特異性酶與顯色基團(tuán)的特有反應(yīng)，使色原游離出來(lái)，沙門菌在培養(yǎng)基上呈紫色或紫紅色，而大腸桿菌等其他腸道桿菌呈藍(lán)綠色。另外，增菌一般使用SC增菌液、SF增菌液（如果樣品是食品，那么還需要用BP增菌液進(jìn)行預(yù)增菌）；分離培養(yǎng)一般使用SS瓊脂、XLD瓊脂、BS瓊脂、沙門菌顯色瓊脂等。