諾如病毒的最新研究進(jìn)展

◎ 仉 薇，吳 鑫，章志超

（江西省食品檢驗(yàn)檢測研究院，江西 南昌 330001）

諾如病毒是全球急性胃腸炎流行和散發(fā)病例最常見的原因，也是食源性胃腸炎的主要原因[1-2]。諾如病毒的感染性很強(qiáng)，很少的病毒量（小于100個(gè)病毒顆粒）即可造成感染，直接通過糞-口途徑傳播，除了導(dǎo)致幼兒、免疫功能低下患者和老年人的高感染率、高死亡率外，還造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅在美國就有2 100萬例病例，每年有70 000例住院和800例死亡[4]，我國2006—2013年全國諾如病毒腹瀉疫情報(bào)告數(shù)也逐年上升，共報(bào)告56起，發(fā)病4 979例，平均每起89例病例[5]。其暴發(fā)通常與貝類或新鮮制備的蔬菜、水果沙拉有關(guān)，一般是由于感染的糞便污染了水或者源于感染的食品處理者[6]。

1 諾如病毒的結(jié)構(gòu)及多樣性

諾如病毒以前被稱為諾瓦克樣病毒，1972年美國學(xué)者Kapikian首先用免疫電鏡技術(shù)從胃腸炎患者的糞便樣本中檢出了該病毒，并且正式定名為諾如病毒[7]。諾如病毒屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，直徑通常在27～37 nm，無囊膜。是基因組長度在7.5～7.7 kb左右的單鏈RNA病毒，有3個(gè)開放閱讀框，ORF-1長約5 kb，ORF-2長約1.8 kb，ORF-3長約0.6 kb，分別編碼非結(jié)構(gòu)多聚蛋白，主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1和強(qiáng)堿性微小結(jié)構(gòu)蛋白[8]。依據(jù)其基因特征，主要分為6個(gè)基因型GⅠ-GⅥ，每個(gè)基因型又包含不同的基因亞型，其中GⅡ.4型占全世界流行的諾如病毒的70%～80%，主要引發(fā)人感染病毒性胃腸炎。諾如病毒易變異，單個(gè)病毒株之間的差異高達(dá)2.8%，基本每隔兩三年便會(huì)出現(xiàn)新的變異株，從而引發(fā)局部大的暴發(fā)流行。

2 諾如病毒的流行病學(xué)和暴發(fā)

目前，諾如病毒在全世界均廣泛流行，1995—2000年，85%以上的暴發(fā)性病毒性胃腸炎系諾如病毒所致[9]。美國疾病控制和預(yù)防中心估計(jì)，美國每年有60%的急性胃腸炎是由諾如病毒感染引起的。我國在山西、北京、安徽、福州、武漢、廣州、廣西等地也先后發(fā)生諾如病毒感染性腹瀉疫情[10]。人類是人諾如病毒的唯一宿主，人群普遍易感，諾如病毒在不同年齡段均可造成感染，且諾如病毒感染在各種環(huán)境中均有報(bào)道，特別是生活區(qū)密集、共用餐飲設(shè)施和環(huán)境維護(hù)困難的地方（如養(yǎng)老院、學(xué)校、醫(yī)院、軍隊(duì)等）。諾如病毒最主要的傳播途徑是糞-口途徑，可通過被污染的食物或水引起人群胃腸炎散發(fā)甚至暴發(fā)。目前，估計(jì)由食物引起的諾如病毒感染胃腸炎可占50%。其中，牡蠣等貝類是最常見的引發(fā)諾如病毒感染的食物，由于牡蠣可以捕獲和富集大量諾如病毒顆粒，并且人們常常生食牡蠣，人吃了帶有大量諾如病毒的牡蠣，就有可能感染諾如病毒，如果此時(shí)在一個(gè)較為封閉的環(huán)境中就很有可能造成諾如病毒感染性胃腸炎，因而對(duì)于牡蠣中諾如病毒的快速檢測是非常有意義的[11]。

3 諾如病毒的臨床特點(diǎn)

諾如病毒的潛伏期在12～72 h，感染者表現(xiàn)為突然發(fā)病，主要癥狀為嘔吐和腹瀉，有些還伴有腹痛和發(fā)熱，平均癥狀持續(xù)時(shí)間在1.2～2.8 d[12]，在1～3 d有86.4%的患者癥狀消失，嚴(yán)重程度和年齡、是否患有合并癥以及免疫功能有一定關(guān)聯(lián)。諾如病毒感染還可表現(xiàn)為無癥狀感染，可在攜帶者糞便中檢測到諾如病毒，但是攜帶者卻沒有表現(xiàn)出常見的感染癥狀，這種情況在兒童中最為常見。諾如病毒的無癥狀排泄具有診斷意義，無癥狀攜帶者可以造成諾如病毒的散播，同時(shí)需要注意無癥狀攜帶者因其他原因引起的腹瀉被誤診為諾如病毒感染[13]。

4 諾如病毒的體外培養(yǎng)

在過去的40多年中，人們嘗試在支持多種病毒生長的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)物（如源自癌變組織的轉(zhuǎn)化細(xì)胞）以及轉(zhuǎn)化的腸上皮細(xì)胞及原代人類免疫細(xì)胞中培養(yǎng)人諾如病毒，但是均以失敗告終[14-15]。此外，諾如病毒是有物種特異性的，人諾如病毒只感染人類并導(dǎo)致人類患病，人諾如病毒并不在小鼠或其他小型模式動(dòng)物體內(nèi)繁殖擴(kuò)增，這極大地限制了諾如病毒疫苗的研究。直到2016年，Khalil Ettayebi的團(tuán)隊(duì)成功在源自人干細(xì)胞的類腸道組織培養(yǎng)物中培養(yǎng)了人諾如病毒，實(shí)現(xiàn)了諾如病毒的體外培養(yǎng)，并且揭示了有些人諾如病毒的復(fù)制依賴膽汁的存在，不同的人諾如病毒在不同腸段的腸上皮細(xì)胞復(fù)制。這一新的培養(yǎng)體系的建立，能夠幫助人們更進(jìn)一步深入研究諾如病毒的進(jìn)化、免疫及發(fā)病機(jī)制，并且有望用于促進(jìn)食品安全，以及新疫苗的研發(fā)等[16]。

5 諾如病毒的檢測

我國是水產(chǎn)品的養(yǎng)殖大國，也是水產(chǎn)品的出口和消費(fèi)大國。近年來，隨著世界各國對(duì)食品安全的重視，我國水產(chǎn)品出口屢屢遭受技術(shù)壁壘，美國和日本、歐盟等許多國家和地區(qū)對(duì)我國的水產(chǎn)品提出了諸多嚴(yán)格的限量指標(biāo)，其中一項(xiàng)規(guī)定是諾如病毒不得檢出[17]。諾如病毒在環(huán)境中生存能力強(qiáng)，感染劑量小，可以通過多種途徑傳播，因而對(duì)于其檢測技術(shù)要求較高。目前，主要的檢測方法有電鏡法、免疫學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測方法。

5.1 電鏡法

電鏡法分為直接電鏡法和免疫電鏡法。在國內(nèi)，方肇寅等首次用直接電鏡法發(fā)現(xiàn)了腹瀉病人大便樣品中的諾如病毒[18]。美國學(xué)者Kapikian在1972年用免疫電鏡法首次觀察到美國諾瓦克鎮(zhèn)腹瀉患者糞便中的諾如病毒[7]。電鏡法是諾如病毒檢測的經(jīng)典方法，但是該方法的缺陷明顯，諾如病毒在電鏡下的形態(tài)并不明顯，判斷依賴于檢測者的經(jīng)驗(yàn)，靈敏度較低，并且操作繁雜，需要專業(yè)人員操作，設(shè)備昂貴，無法廣泛普及，不適于臨床研究及大規(guī)模的普查。

5.2 免疫學(xué)檢測法

免疫學(xué)方法主要包括放射免疫法、生物素-親和素免疫法和酶聯(lián)免疫法。近年來，利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)諾如病毒蛋白從而建立快速檢測方法不斷涌現(xiàn)。免疫法的特點(diǎn)是操作簡便，耗時(shí)較少，但是其靈敏度不高。

5.3 分子生物學(xué)檢測法

分子生物學(xué)方法包括常規(guī)PCR、巢氏PCR、熒光定量PCR等。熒光定量PCR現(xiàn)已成為諾如病毒診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，廣泛應(yīng)用于諾如病毒的檢測。但是，由于諾如病毒的多樣性，要設(shè)計(jì)出一對(duì)通用引物是該方法的難點(diǎn)；并且，由于熒光定量PCR系統(tǒng)的開放性，很容易發(fā)生交叉污染，造成假陽性，對(duì)診斷造成干擾。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，多重?zé)晒舛縋CR能同時(shí)診斷多種腸道病毒如諾如病毒、星狀病毒和輪狀病毒。該方法能用于低濃度的諾如病毒檢測，還能夠進(jìn)一步對(duì)病毒進(jìn)行分型，對(duì)諾如病毒流行病學(xué)的研究有重要意義[19]。

6 諾如病毒的預(yù)防與治療

若人們食用了被諾如病毒污染的食物，則易于引起諾如病毒的感染甚至暴發(fā)。以最常見的牡蠣為例，由于受污染的牡蠣暴發(fā)呈現(xiàn)不同的季節(jié)性，因而可以提前做好檢測工作，從而防患于未然，防止因食用牡蠣導(dǎo)致諾如病毒的暴發(fā)。另外，針對(duì)封閉或半封閉的環(huán)境，加強(qiáng)環(huán)境衛(wèi)生管理以及增強(qiáng)個(gè)人衛(wèi)生意識(shí)是非常重要的[20]。

人諾如病毒感染一般具有自限性，因而臨床治療以對(duì)癥治療和支持療法為主，治療的關(guān)鍵在于針對(duì)腹瀉和脫水的補(bǔ)液治療，病情嚴(yán)重的患者還需要糾正酸中毒和電解質(zhì)代謝異常。由于還沒有特效的抗病毒藥物和疫苗，在這兩個(gè)領(lǐng)域也是涌現(xiàn)許多新成果。隨著越來越多諾如病毒蛋白結(jié)構(gòu)的解析，通過計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)靶向的抗病毒藥物成為可能。研究發(fā)現(xiàn)，不同毒株的諾如病毒存在許多相似的保守結(jié)構(gòu)，通過對(duì)這些保守結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步探索，可能產(chǎn)生有效對(duì)抗諾如病毒毒株多樣性的抑制劑。迄今為止，已經(jīng)測試了主要靶向病毒蛋白的大量候選抑制劑，但是其活性通常較低，不能達(dá)到預(yù)期效果[21]。而在諾如病毒疫苗研究方面，主要焦點(diǎn)在于如何構(gòu)建能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生較好免疫反應(yīng)、耐熱、耐酸的病毒樣顆粒。全球多個(gè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開展了諾如病毒樣顆粒疫苗及亞單位疫苗的臨床前研究及臨床試驗(yàn)。

7 展望

諾如病毒在全球范圍造成了較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，雖然人們?cè)诳共《舅幬锖鸵呙绲难邪l(fā)方面做了許多積極的嘗試，但是目前為止仍然沒有一種藥物用于預(yù)防諾如病毒的感染或臨床治療。這與針對(duì)腸道病原體的所有抑制劑一樣，與抑制劑能否被準(zhǔn)確地遞送至復(fù)制點(diǎn)并且能夠在腸道環(huán)境中穩(wěn)定發(fā)揮效用有關(guān)。除了在抗病毒藥物和疫苗方面仍需繼續(xù)探索外，諾如病毒細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的建立及人諾如病毒動(dòng)物模型的構(gòu)建也是今后發(fā)展的重點(diǎn)。這兩個(gè)系統(tǒng)的完善能夠幫助人們進(jìn)一步認(rèn)識(shí)諾如病毒的特性，并且能夠給治療藥物的研發(fā)提供試驗(yàn)條件。在此之前，采取有效的檢疫和衛(wèi)生預(yù)防措施仍舊是控制諾如病毒感染的最好選擇。

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