DNA倍體分析在肺癌診斷中的應(yīng)用價值*

石安琪綜述，江 濤審校（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，重慶400016）

在我國，肺癌已成為癌癥死亡的首要病因。肺癌是發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，其5年生存率僅為16%，明顯低于如結(jié)腸癌、乳腺癌和前列腺癌等其他類型的腫瘤[1]。在過去的20年里，肺癌的治療方法不斷改進(jìn)，但肺癌患者的5年生存率仍然只有6%～18%。若肺癌能被早期診斷，肺癌患者的5年生存率可大大提高，甚至可提高至67%[2]。因此，及時、準(zhǔn)確地診斷肺癌對指導(dǎo)臨床治療極為重要。目前，液基細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)檢查是肺癌診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[3-4]，但上述2種診斷方法均由病理科醫(yī)生肉眼診斷，結(jié)果具有一定的主觀性，存在一定的漏診率。DNA倍體分析技術(shù)通過對細(xì)胞DNA水平定量，了解細(xì)胞倍體變化情況，輔助診斷惡性腫瘤。因其具有客觀、方便、重復(fù)性強等優(yōu)點，近年來愈發(fā)受到腫瘤研究者的重視。多項研究顯示，DNA倍體分析對宮頸癌、食管癌、口腔黏膜癌等腫瘤的診斷具有重要意義[5-8]。本文擬對DNA倍體分析技術(shù)在肺部惡性腫瘤中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 細(xì)胞DNA倍體分析技術(shù)的原理

DNA是細(xì)胞生長、分化、繁殖的基礎(chǔ)。人正常細(xì)胞染色體的數(shù)目和形狀相對穩(wěn)定。隨著細(xì)胞的生長繁殖，細(xì)胞核的DNA結(jié)構(gòu)和水平也會發(fā)生改變。每一個體細(xì)胞具有46條染色體，可配成23對，稱為二倍體。當(dāng)細(xì)胞處于有絲分裂活動時可為四倍體。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生癌變時，基因發(fā)生丟失、重組、融合、擴增等變化，導(dǎo)致細(xì)胞DNA水平變化，為非整倍體細(xì)胞。因此，以正常細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)對照，測定被檢測細(xì)胞DNA水平，發(fā)現(xiàn)異常DNA水平細(xì)胞，可有助于腫瘤早期診斷[9-10]。DNA倍體分析是使用吸收光譜分析測量染色情況，細(xì)胞核特異性染色，染色的深淺與DNA水平成比例。顏色深淺通過電腦圖像處理轉(zhuǎn)變?yōu)榉e分吸光度（IOD），被測細(xì)胞IOD值與正常細(xì)胞IOD值的比值則為DNA指數(shù)（DI）。人體超過90%的細(xì)胞處于細(xì)胞周期中的靜止期（G0期），為二倍體，其DI為1；G1期是細(xì)胞周期中的第1個階段，細(xì)胞尚未增殖，DI為1；S期為DNA復(fù)制期，DI為 1～2；G2期為有絲分裂前期，DNA 倍增，DI為 2；M 期為有絲分裂期，細(xì)胞分裂為2個子細(xì)胞，DNA水平又恢復(fù)到二倍體。應(yīng)用細(xì)胞分析儀進(jìn)行DNA測量，可反映細(xì)胞染色體的畸變。

目前，DNA定量分析的方法主要有2種：一種是流式細(xì)胞術(shù)，采用流式細(xì)胞儀對懸液中快速直線運動的、熒光標(biāo)記的大量單細(xì)胞進(jìn)行快速、精確的定量分析[11]；另一種是靜態(tài)圖像分析術(shù)，通過對細(xì)胞DNA特異染色（如Feulgen染色、甲基綠-派洛寧染色、熒光染色等，其中Feulgen染色相對便宜、簡便且效果穩(wěn)定，應(yīng)用最多），然后在顯微鏡下對靜態(tài)細(xì)胞圖像進(jìn)行定量分析。與流式細(xì)胞術(shù)比較，靜態(tài)圖像分析術(shù)可以結(jié)合細(xì)胞形態(tài)，并可以存儲已經(jīng)分析的細(xì)胞，故目前DNA靜態(tài)圖像分析術(shù)應(yīng)用更加廣泛[11-13]。臨床應(yīng)用DNA靜態(tài)圖像分析技術(shù)的結(jié)果可分為3個等級：（1）陰性，未見DNA倍體異常細(xì)胞；（2）可疑，可見少量DNA倍體異常細(xì)胞（1～2個細(xì)胞DI值大于或等于2.5），可見細(xì)胞異常增生（≥10%）；（3）高度懷疑腫瘤，可見DNA倍體異常細(xì)胞（3個及以上細(xì)胞DI值大于或等于2.5），可見異倍體細(xì)胞峰，異常細(xì)胞增生（＞10%）[9-10，14-15]。

2 細(xì)胞DNA倍體分析在肺部疾病中的研究現(xiàn)況

近年來，細(xì)胞DNA倍體分析技術(shù)愈發(fā)受到研究者的重視，其在肺部疾病方面的研究日益增多。對肺部腫瘤的診斷，常通過對胸腔積液、肺泡灌洗液、痰液等標(biāo)本的檢查來指導(dǎo)臨床。

2.1 胸腔積液 細(xì)胞學(xué)檢查是輔助診斷胸腔積液的主要方法。由于胸腔積液細(xì)胞學(xué)檢查陽性率較低，而病理科醫(yī)生的主觀因素對診斷結(jié)果有一定影響，故胸腔積液良惡性的鑒別診斷常是臨床醫(yī)生面臨的難題。DNA倍體分析技術(shù)用于鑒別良惡性胸腔積液的研究頗多，但DNA倍體分析在胸腔積液中的診斷價值尚有爭議。張素霞等[16]、馮加喜等[17]的研究結(jié)果顯示，DNA倍體分析對惡性胸腔積液診斷的特異度較高，但敏感度較低，用于輔助鑒別良惡性胸腔積液的價值較大，但并不適用于篩查惡性胸腔積液。SAHA等[18]、OSTERHELD 等[19]、BISHT 等[20]及郭光云等[21]的研究結(jié)果顯示，DNA倍體分析可避免主觀因素的影響，補充細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果，尤其是在細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果模棱兩可的時候。多項研究證實，將DNA倍體分析聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查對胸腔積液良惡性的鑒別診斷價值優(yōu)于單一診斷方法[19，22-24]。在胸腔積液中的診斷價值方面，MOTHERBY等[25]的研究結(jié)果表明，DNA靜態(tài)圖像分析術(shù)優(yōu)于流式細(xì)胞術(shù)。胸腔積液中DNA異倍體細(xì)胞水平與預(yù)后呈負(fù)性相關(guān)，異倍體細(xì)胞數(shù)越多，預(yù)后越差，患者的中位生存期越短[26]。

2.2 肺泡灌洗液（BALF） 支氣管鏡檢查是目前臨床上常用的肺癌定位、定性微創(chuàng)診斷工具，應(yīng)用廣泛。DNA倍體分析技術(shù)在BALF中的診斷價值研究逐漸增多。樊娜等[27]的研究結(jié)果顯示，DNA倍體分析對BALF標(biāo)本中肺癌的診斷價值不及病理學(xué)檢查；也有多項研究揭示了DNA倍體分析有較大診斷價值[28-30]，其聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查可以提高對肺癌的陽性檢出率，降低漏診率，且對肺癌患者而言，鱗癌的檢測敏感度高于腺癌。相關(guān)研究結(jié)果的差異可能與支氣管鏡檢醫(yī)生的操作技術(shù)、腫瘤部位有關(guān)。

2.3 痰液 痰液標(biāo)本收集簡便且無創(chuàng)，目前，痰細(xì)胞學(xué)檢查已廣泛應(yīng)用于臨床高危人群的肺癌篩查。但痰細(xì)胞學(xué)檢查的陽性率低，可能與咳痰要求、標(biāo)本質(zhì)量及病理學(xué)醫(yī)生的經(jīng)驗等有關(guān)，導(dǎo)致其應(yīng)用存在局限性[31-33]。將DNA倍體分析技術(shù)應(yīng)用于痰液標(biāo)本檢測中，肺癌的陽性診斷率明顯高于痰細(xì)胞學(xué)檢查，這對肺癌的早期診斷有一定價值[34-36]。

3 DNA倍體與預(yù)后的關(guān)系

多項研究結(jié)果顯示，DNA異倍體率與肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。DNA異倍體率越高，腫瘤的惡性程度越大，發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的可能性越大[37-38]。夏宗江等[39]的研究揭示了原發(fā)性肺癌組織中DNA異倍體率隨腫瘤進(jìn)展逐漸升高，異倍體細(xì)胞的凋亡率較二倍體細(xì)胞明顯降低，凋亡率隨分期的增高而遞減[40-41]，高DI值的腫瘤對化療較敏感。

4 DNA倍體分析的局限性

不論是何種標(biāo)本，DNA倍體分析同樣可能有假陽性、假陰性結(jié)果[5，7，42-45]。研究表明，假陰性結(jié)果可能與下列原因相關(guān)：（1）腫瘤的異質(zhì)性，腫瘤本身就是二倍體；（2）需要有相當(dāng)數(shù)量的DNA異常細(xì)胞才可以檢測到；（3）較小的染色體異?？赡軣o法被檢測到；（4）某些DNA的丟失與復(fù)制平衡時，腫瘤細(xì)胞的DNA測值正常；（5）不同醫(yī)生的肺泡灌洗技術(shù)不同，且受腫瘤部位影響，標(biāo)本質(zhì)量欠佳[17，46]。而假陽性的出現(xiàn)可能與細(xì)胞受到細(xì)菌、真菌、病毒等感染的影響，以及過度反應(yīng)性增生相關(guān)[47]。有研究發(fā)現(xiàn)，DNA倍體分析診斷惡性腫瘤可以比組織學(xué)診斷提前1～15個月[48-49]。DNA倍體分析不能辨別病變細(xì)胞類型，僅提示細(xì)胞有病變。

5 DNA倍體分析的診斷閾值

目前，宮頸病變的DNA異倍體診斷標(biāo)準(zhǔn)已明確，陽性診斷閾值為DI值大于2.5，細(xì)胞數(shù)大于或等于3[5]；口腔癌中的陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)為DI大于2.3，細(xì)胞數(shù)大于或等于3[50]。但目前DNA倍體分析在胸腔積液中的陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未完全明確，多項關(guān)于DNA倍體分析在胸腔積液中診斷閾值的研究，其結(jié)果差異較大。孟芝蘭等[51]的研究顯示，當(dāng)DI大于2.5、細(xì)胞數(shù)大于或等于1時，診斷價值最大；但其另一項研究結(jié)果顯示，陽性診斷閾值為DI大于2.5，細(xì)胞數(shù)大于或等于4[52]。張素霞等[16]的研究結(jié)果顯示，當(dāng)DI值大于2.5、細(xì)胞數(shù)大于或等于3時有最大診斷價值，而該結(jié)果與GUILLAUD等[5]的研究結(jié)果類似，說明DNA倍體分析在肺癌中的診斷閾值與其他類型標(biāo)本不同，還需更大樣本的研究明確陽性診斷閾值。

6 小 結(jié)

DNA倍體分析在肺癌診斷中有一定的應(yīng)用價值，與腫瘤的侵襲及預(yù)后有一定關(guān)系，但其陽性診斷閾值還需進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。

[1]PENDHARKAR D，AUSEKAR BV，GUPTA S.Molecular biology of lung cancer—a review[J].Indian J Surg Oncol，2013，4（2）：120-124.

[2]CUI JW，LI W，HAN FJ，et al.Screening for lung cancer using low-dose computed tomography：concerns about the application in low-risk individuals[J].Trans Lung Cancer Res，2015，4（3）：275-286.

[3]FAN YB，WANG QS，YE L，et al.Clinical application of the sure path liquid-based pap test in cytological screening of bronchial brushing for the diagnosis of lung cancer[J].Cytotechnology，2010，62（1）：53-59.

[4]MICHAEL CW，BEDROSSIAN CC.The implementation of liquid-based cytology for lung and pleural-based diseases[J].Acta Cytol，2014，58（6）：563-573.

[5]GUILLAUD M，BENEDET JL，CANTOR SB，et al.DNA ploidy compared with human papilloma virus testing（hybrid captureⅡ）and conventional cervical cytology as a primary screening test for cervical highgrade lesions and cancer in 1 555 patients with biopsy confirmation[J].Cancer，2006，107（2）：309-318.

[6]DUARTE CE，SILVA-FILHO AL.Adaptation of image cytometry methodology for DNA ploidy analysis of cervical epithelium samples：a pilot study[J].Taiwan J Obstet Gynecol，2014，53（2）：227-231.

[7]K?MMERER PW，KOCH FP，SANTORO M，et al.Prospective，blinded comparison of cytology and DNA-image cytometry of brush biopsies for early detection of oral malignancy[J].Oral Oncol，2013，49（5）：420-426.

[8]ZHAO L，WEI WQ，ZHAO DL，et al.Population-based study of DNA image cytometry as screening method for esophageal cancer[J].World J Gastroenterol，2012，18（4）：375-382.

[9]DURSO V，COLLODORO A，MATTIOLI E，et al.Cytometry and DNA ploidy：clinical uses and molecular perspective in gastric and lung cancer[J].J Cell Physiol，2010，222（3）：532-539.

[10]LI G，GUILLAUD M，F(xiàn)OLLEN M，et al.Double staining cytologic samples with quantitative Feulgen-thionin and anti-Ki-67 immunocytochem-istry as a method of distinguishing cells with abnormal DNA content from normal cycling cells[J].Anal Quantit Cytol，2012，34（5）：273-284.

[11]吳曉娜，蔣紅兵.流式細(xì)胞術(shù)的工作原理及其臨床應(yīng)用[J].中國醫(yī)療設(shè)備，2011，26（3）：91-93.

[12]李東華，王占民，夏仲玲.圖像分析技術(shù)在惡性腫瘤研究中的應(yīng)用價值[J].國際腫瘤學(xué)雜志，2000，7（5）：294-295.

[13]沈丹華.DNA圖像分析的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)及其在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用[J].中國腫瘤臨床，1996，23（12）：898-901.

[14]孫小蓉，李玉蘭，車東媛，等.用細(xì)胞DNA定量分析方法進(jìn)行宮頸癌普查的臨床研究[J].診斷病理學(xué)雜志，2005，12（1）：12-16.

[15]DEMIRELDA，RAMZYI.Diagnosticandprognosticsignificanceofimage cytometric DNA ploidy measurement in cytological samples of cervical squamousintraepitheliallesions[J].Cytopathology，2013，24（2）：105-112.

[16]張素霞，周紅，宇小婷，等.全自動DNA定量分析檢測對惡性胸腔積液診斷的價值[J].中華病理學(xué)雜志，2015，44（9）：653-654.

[17]馮加喜，陳葆國，林云.胸液細(xì)胞DNA倍體分析和癌胚抗原測定在惡性胸液中診斷價值的對比研究[J].中國呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2003，2（2）：77-78.

[18]SAHA I，DEY P，VHORA H，et al.Role of DNA flow cytometry and imagecytometryoneffusionfluid[J].DiagnCytopathol，2000，22（2）：81-85.

[19]OSTERHELD MC，ANCA M.Image cytometry：an aid for cytological diagnosis of pleural effusions[J].Diagn Cytopathol，2005，32（3）：173-176.

[20]BISHT B，HANDA U，MOHAN H，et al.Complementary value of DNA flow cytometry and image morphometry in detection of malignant cells in effusion fluids[J].Malays J Pathol，2014，36（2）：83-90.

[21]郭光云，張立波，陳功，等.DNA倍體分析系統(tǒng)鑒別良惡性胸腔積液的價值[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（2）：183-185.

[22]王應(yīng)霞，張旋，吳瑩瑩，等.液基細(xì)胞學(xué)檢測聯(lián)合DNA倍體分析在良惡性胸腹水鑒別診斷中的應(yīng)用[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2016，32（10）：1152-1155.

[23]姜濤.DNA倍體分析在胸腔積液診斷中的應(yīng)用價值[J].中國醫(yī)師進(jìn)修雜志，2012，35（16）：28-30.

[24]RODRIGUEZ CF，MOLERO T，ACOSTA O，et al.Value of DNA analysis in addition to cytological testing in the diagnosis of malignant pleural effusions[J].Thorax，1994，49（7）：692-694.

[25]MOTHERBY H.Diagnostic DNA-flow-vs-image-cytometry in effusion cytology[J].Anal Cell Pathol，2002，24（1）：5-15.

[26]BENLLOCHS，MARTI-CIRIQUIANJL，GALBIS-CARAVAJALJM，etal.Cell-free DNA concentration in pleural fluid and serum：quantitative approach and potential prognostic factor in patients with cancer and pleural effusions[J].Clin Lung Cancer，2006，8（2）：140-145.

[27]樊娜，張玉萍，孟夏，等.DNA異倍體檢測在肺癌早期診斷中的價值[J].中華肺部疾病雜志，2015，8（6）：18-22.

[28]陶偉，李俊，程柳柳.細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)在肺癌診斷中的應(yīng)用價值[J].中華腫瘤雜志，2016，38（2）：113-117.

[29]MATTHYS H.Pneumologie unterrepr?sentiert[J].Med Klin，1998，93（7）：455.

[30]譚焰，孫麗華，方蘇榕.支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞DNA含量分析在周圍型肺癌中的診斷價值[J].臨床肺科雜志，2009，14（1）：53-54.

[31]秦天娥，譚琳.痰液病理細(xì)胞學(xué)及纖維支氣管鏡檢查對肺部腫塊的診斷 71 例分析[J].華西醫(yī)學(xué)，2006，21（4）：801-802.

[32]盧珊珊，曹箭，潘秦鏡，等.痰液基薄層技術(shù)在肺癌診斷中的價值及影響因素分析[J].中國醫(yī)刊，2010，45（1）：44-46.

[33]SCHREIBER G，MCCRORY DC.Performance characteristics of different modalities for diagnosis of suspected lung cancer：summary of published evidence[J].Chest，2003，123（S1）：115-128.

[34]YANG J，ZHOU YK.Detection of DNA aneuploidy in exfoliated airway epithelia cells of sputum specimens by the automated image cytometry and its clinical value in the identification of lung cancer[J].J Huazhong U Sci Med，2004，24（4）：407-410.

[35]XING S，KHANAVKAR B，NAKHOSTEEN JA，et al.Predictive value of image cytometry for diagnosis of lung cancer in heavy smokers[J].Eur Respir J，2005，25（6）：956-963.

[36]操樂杰，翟志敏，李俊，等.痰液細(xì)胞DNA含量分析對肺癌的診斷價值[J].中國肺癌雜志，2004，7（3）：202-205.

[37]季洪波，張華，沈曉玲，等.DNA倍體分析在肺癌中的意義[J].內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志，2006，38（6）：506-508.

[38]KASPRZYK M，DYSZKIEWICZ W，PIWKOWSKI C，et al.Prognostic value of DNA ploidy：5-year follow-up of patients with resectable squamous cell carcinoma（SCC）of the lung[J].Lung Cancer，2006，51（2）：201-206.

[39]夏宗江，趙松，王家祥.肺癌組織中DNA倍體、SPF、PI值測定的臨床意義[J].醫(yī)學(xué)信息（手術(shù)學(xué)分冊），2007，20（3）：247-248.

[40]薛曉霞，張瑩，蔣東華，等.女性肺腺癌CD44表達(dá)、DNA含量和凋亡率的相關(guān)性研究[J].中國肺癌雜志，2007，10（5）：381-385.

[41]薛曉霞.女性非小細(xì)胞肺癌CD44、CD82表達(dá)、DNA含量和凋亡率的相關(guān)性研究[D].沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2007.

[42]MA JM，ZHOU TJ，WANG R，et al.Brush biopsy with DNA-image cytometry：a useful and noninvasive method for monitoring malignant transformation of potentially malignant oral disorders[J].Eur Arch Otorhinolaryngol，2014，271（12）：3291-3295.

[43]LAZCANO O，CHEN LM，TSAI C，et al.Image analysis and flow cytometric DNA studies of benign and malignant body cavity fluids：reappraisal of the role of current methods in the differential diagnosis of reactive versus malignant conditions[J].Mod Pathol，2000，13（7）：788-796.

[44]BABA H，KORENAGA D，KAKEJI Y，et al.DNA ploidy and its clinical implications in gastric cancer[J].Surgery，2002，131（S1）：S63-S70.

[45]FURUYA T，UCHIYAMA T，MURAKAMI T，et al.Relationship between chromosomal instability and intratumoral regional DNA ploidy heterogeneity in primary gastric cancers[J].Clin Cancer Res，2000，6（7）：2815-2820.

[46]樊英，李龍蕓.流式細(xì)胞儀DNA倍體分析用于良惡性胸腔積液的鑒別診斷[J].癌癥進(jìn)展，2005，3（3）：248-249.

[47]GARNER D.Clinical application of DNA ploidy to cervical cancer screening：a review[J].World J Clin Oncol，2014，5（5）：931-965.

[48]REMMERBACH TW，WEIDENBACH H，HEMPRICH A，et al.Earliest detection of oral cancer using non-invasive brush biopsy including DNA-image-cytometry：report on four cases[J].Anal Cell Pathol，2003，25（4）：159-166.

[49]MARAKI DB，BOECKING A.Cytologic and DNA-cytometric very early diagnosis of oral cancer[J].J Oral Pathol Med，2004，33（7）：398-404.

[50]BRADLEY G，ODELL EW，RAPHAEL S，et al.Abnormal DNA content in oral epithelial dysplasia is associated with increased risk of progression to carcinoma[J].Br J Cancer，2010，103（9）：1432-1442.

[51]孟芝蘭，高亮，顧建剛，等.全自動DNA定量分析系統(tǒng)在胸腔積液細(xì)胞病理診斷中的應(yīng)用[J].協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志，2012，3（1）：36-40.

[52]MENG ZL，SHI J，ZHU CY，et al.Automated quantification of DNA aneuploidy by image cytometry as an adjunct for the cytologic diagnosis of malignant effusion[J].Anal Cell Pathol（Amst），2013，36（3/4）：107-115.