基于基層實(shí)驗(yàn)條件的幾種獸醫(yī)血清學(xué)試驗(yàn)方法改進(jìn)

賀鵬程

(甘肅省莊浪縣畜牧獸醫(yī)局，甘肅 莊浪 744699)

近年來，隨著基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的不斷推進(jìn)，常用血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)得到普遍推廣和應(yīng)用，其在動(dòng)物疫病防控中的作用日漸凸顯。但是，受制于基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)投入不足，實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)陋，實(shí)驗(yàn)耗材、診斷試劑不能充足供應(yīng)，實(shí)驗(yàn)人員崗位變動(dòng)頻繁，技術(shù)良莠不齊，試劑耗材價(jià)格居高不下，檢測(cè)數(shù)量不斷增加等因素，在獸醫(yī)血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)許多環(huán)節(jié)都日益完善的今天，如何在諸多不利條件下更加準(zhǔn)確快速的開展血清學(xué)試驗(yàn)，仍有不斷努力的空間。

小反芻獸疫、包蟲病、狂犬病等重大動(dòng)物疫病的監(jiān)測(cè)和免疫抗體檢測(cè)。在基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室上述幾種試驗(yàn)常用且質(zhì)量可靠的診斷試劑主要采用青島某中心、蘭州某研究所、哈爾濱某研究所生產(chǎn)或提供技術(shù)支撐公司生產(chǎn)。

筆者在嚴(yán)格遵守上述幾種試驗(yàn)相關(guān)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)如《高致病性禽流感診斷技術(shù)》(GB/T18936-2003)、《口蹄疫診斷技術(shù)》(GB/T 18935-2003)和試劑盒說明書及所在實(shí)驗(yàn)室《質(zhì)量手冊(cè)》等基礎(chǔ)上，本著節(jié)約診斷試劑，提高檢測(cè)效率，保證檢測(cè)質(zhì)量，快速完成檢測(cè)任務(wù)的目的，根據(jù)多年實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)，對(duì)原有試驗(yàn)方法的某個(gè)點(diǎn)或部分做了適應(yīng)性修改。本文現(xiàn)將這些修改逐一介紹，以供獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員、診斷試劑生產(chǎn)單位和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)修訂做參考。

1 布病虎紅平板凝集試驗(yàn)

1.1 修改結(jié)果判定方法

將原受檢血清在4 min內(nèi)判定結(jié)果，改為4 min±20s范圍內(nèi)判定結(jié)果。

1.2 修改目的及效果

明確了肉眼觀察的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，減少了誤判，全程觀察時(shí)間由240 s縮短到40 s,提高了可操作性，提升了檢測(cè)效率。

1.3 適用條件

適用于動(dòng)物布病篩查。

2 布病試管凝集試驗(yàn)(SAT)

2.1 修改血清稀釋方法

將原羊、豬血清稀釋方法，第一管加1.15 mL稀釋液，加血清0.1 mL混勻后再棄去0.25 mL，再對(duì)倍稀釋至第4管。改為，第一管加0.92 mL稀釋液，加血清0.08 mL混勻，再對(duì)倍稀釋至第4管；將原牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋方法，第一管加1.2 mL稀釋液，加血清0.05 mL混勻后再棄去0.25 mL，再對(duì)倍稀釋至第4管。改為，第一管加0.96 mL稀釋液，加血清0.04 mL混勻，再對(duì)倍稀釋至第4管。

2.2 修改目的及效果

減少了第1管混勻后的棄去環(huán)節(jié)，減少了反復(fù)加減多次操作造成的誤差，提高了檢測(cè)效率，原稀釋比例不變。

2.3 適用條件

普遍適用，樣品數(shù)量較多時(shí)尤適用。

3 正向間接血凝試驗(yàn)(IHA)

3.1 修改加樣方案

將96孔微量反應(yīng)板從中間劃線一分為二，第一孔原來加血清和稀釋液各50μL優(yōu)化為加血清25 μL、稀釋液75μl從而使稀釋度由第一孔的1∶2變?yōu)?∶4，依次做2倍系列稀釋至第6孔，第6孔的稀釋度由1∶64變?yōu)?∶128，大于1∶32的判定標(biāo)準(zhǔn)兩個(gè)稀釋度，反應(yīng)板劃線右側(cè)同左側(cè)。

3.2 修改目的及效果

使原來每個(gè)反應(yīng)板檢8份樣品增加到16份樣品，節(jié)約了試劑，提高了檢測(cè)效率，滿足定性判定要求，不影響判定結(jié)果。

3.3 適用條件

該項(xiàng)修改滿足抗體檢測(cè)結(jié)果≥1∶32判為陽性等只做定性判定，對(duì)最終效價(jià)不做確認(rèn)的大量樣本普檢?？乖仍噭┎蛔銜r(shí)尤適用。

4 血凝和血凝試驗(yàn)(HA-HI)

4.1 修改加樣方案

將微量反應(yīng)板向右旋轉(zhuǎn)90°加樣，原來橫向2倍系列稀釋至第10孔，11、12孔為對(duì)照，變?yōu)闄M向2倍系列稀釋至第6孔，第7、8孔為對(duì)照，使每板由可檢8份樣品增加至12份。

4.2 修改目的及效果

使原來每個(gè)反應(yīng)板檢8份樣品增加到12份樣品，節(jié)約了診斷試劑，提高了檢測(cè)效率，滿足定性判定要求，不影響判定結(jié)果。

4.3 適用條件

該項(xiàng)修改滿足抗體檢測(cè)結(jié)果≥1∶16判為陽性等只做定性判定，對(duì)最終效價(jià)不做確認(rèn)的大量樣本普檢。抗原等試劑不足時(shí)尤適用。

5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(間接ELISA)

5.1 修改結(jié)果判定方法

將原來結(jié)果計(jì)算公式“樣品效價(jià)=(OD樣品-OD陰性)÷(OD陽性-OD陰性)，樣品效價(jià)>n為陽性(n為常數(shù))”需要逐孔OD值帶入公式計(jì)算，修改為n值代入公式變換不等式先計(jì)算出“臨界值OD值”再逐孔樣品OD值比較大小。

5.2 修改目的及效果

減少了大量重復(fù)計(jì)算，降低了計(jì)算過程中出錯(cuò)的幾率，大幅提高了判定速度，樣品數(shù)量較多時(shí)效果尤為明顯。

5.3 適用條件

只適用于使用上述公式或類似方法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算的間接ELISA試劑盒，不適用陽性、陰性、空白對(duì)照的計(jì)算。

6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(液相阻斷ELISA)

6.1 新建1板檢測(cè)80份加樣方案

取兩塊稀釋板，第一塊1～10列每孔加稀釋液150 μL，第二塊稀釋板1～10列每孔加稀釋液50 μL，再在第一塊1～10列逐孔依次加被檢血清10 μL(稀釋比例為1∶16)，混勻后取50 μL轉(zhuǎn)移到第二塊稀釋板(稀釋比例為1∶32)，混勻后棄去50 μL，加病毒抗原每孔50 μL(稀釋比例為1∶64)。

6.2 修改目的及效果

新建1塊反應(yīng)板檢測(cè)血清稀釋比全部為1∶64的加樣稀釋方案，可大量減少反應(yīng)板及診斷試劑使用量，樣品數(shù)量較多時(shí)可有效提高檢測(cè)效率。

6.3 適用條件

該方案僅適用于蘭州某研究所生產(chǎn)的口蹄疫A型、O型、亞Ⅰ型口蹄疫液相阻斷ELISA試劑盒，同時(shí)判定結(jié)果為農(nóng)業(yè)部要求的抗體效價(jià)≥1∶64為陽性，抗體效價(jià)<1∶64為陰性的大量樣品的檢測(cè)，不適用于試劑盒說明書抗體效價(jià)≥1∶128為陽性，效價(jià)<1∶64為陰性，效價(jià)在1∶64～1∶128為可疑的判定標(biāo)準(zhǔn)。