哺乳動物早期胚胎熱休克蛋白70的研究進展

屈平平，李 濤，胡士林

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，山東 濰坊 261061）

在哺乳動物胚胎發(fā)育早期，如果母體或胚胎受到高溫、放射線、活性氧、重金屬離子、毒性物質(zhì)的侵害，則可能導致胚胎細胞超微結(jié)構(gòu)受損；各種細胞器的正常功能被破壞，細胞凋亡增加；胚胎發(fā)育潛能降低、發(fā)育阻滯、死亡。牛2-細胞期胚胎經(jīng)過熱應激處理后，胚胎線粒體腫脹，卵周隙、核周間隙增大，細胞器從卵胞漿邊緣向中央遷移。強熱應激組胞漿和核漿空泡化，蛋白質(zhì)、核內(nèi)染色質(zhì)變性，卵裂球表面絨毛減少，溶酶體增多[1]。妊娠1 d母鼠35℃熱應激12 h后，大多數(shù)胚胎在2-細胞期發(fā)育阻滯，發(fā)育到囊胚的比例僅為24.3%，受精卵的谷胱甘肽含量顯著降低[2]。熱應激造成早期胚胎發(fā)育阻滯或死亡的現(xiàn)象在各種家畜均可發(fā)生，且發(fā)生率較高，在人類熱應激導致10%～15%的早期流產(chǎn)發(fā)生，其中，30%發(fā)生在囊胚至著床期[3]。

雖然熱應激會對胚胎造成一定的損傷，但胚胎能對熱應激做出應答反應，其中，熱休克蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）就是應答反應的主要產(chǎn)物之一。大量試驗研究表明熱環(huán)境、重金屬（如砷）、缺血、炎癥、乙醇、氨基酸類似物、某些臨床藥物（如水楊酸鈉等）、視黃酸類化合物等100多種應激原均可誘導細胞產(chǎn)生大量HSPs，保護細胞結(jié)構(gòu)完整和生理功能正常。HSP70是分子量在68～78 kD之間的一組熱休克蛋白，是HSP家族最為保守的一族。HSPs從受精卵開始即有表達，結(jié)構(gòu)型的熱休克蛋白70（HSC70）是著床前最主要表達的蛋白。在正常生理條件下，HSC70主要以“分子伴娘”的形式介導其他蛋白正確折疊、組裝和分布，參與細胞正常的生長、發(fā)育和分化。應激時產(chǎn)生的誘導型熱休克蛋白70（HSP70）在囊胚時開始表達，通過分子伴侶作用，增加細胞熱耐受性，抑制細胞凋亡等途徑保護胚胎免受應激引起的損傷，保證胚胎正常發(fā)育。

近幾十年來，人們以母體應激和體外胚胎培養(yǎng)為試驗模型，利用免疫細胞化學技術(shù)、免疫印記、核酸分子雜交、RT-PCR和單、雙向電泳等分子生物學技術(shù)，從發(fā)育學的角度探討了HSP70與胚胎生長發(fā)育和畸形發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系，并取得大量成果。從國內(nèi)外的研究趨勢上看，HSP70將是今后若干年胚胎發(fā)育和致畸領(lǐng)域研究的主要內(nèi)容之一。

1 HSP70的特性

HSP70為熱休克蛋白家族中最為重要、最保守、含量最多的一族，包括68、72、73、75、78 KD等共有21種蛋白質(zhì)，他們具有相同的酸性等電點和相似的胰蛋白酶肽譜，具有“卷線樣”構(gòu)象段。熱休克蛋白70按照其產(chǎn)生的方式可分為結(jié)構(gòu)型熱休克蛋白70（HSC70）和誘導型熱休克蛋白70（HSP70）2種，二者統(tǒng)稱為HSP70。兩種熱休克蛋白70的氨基酸序列具有90%的同源性，功能也十分相似；但是HSC70和HSP70mRNA表達在時間和空間上有所不同，表達閾值也不同[4]。HSP70具高度的同源性和普遍性，HSP70幾乎存在于所有動物的各種組織細胞中，而且不同HSP70 N端2/3部分較C端1/3部分保守的多。正常情況下HSP70在細胞內(nèi)呈基礎(chǔ)表達，表達水平較低，以可溶性的形式存在于胞漿中。當細胞遭受應激，HSP70快速、顯著的合成，一般數(shù)分鐘即可達到最高水平，這是因為HSP70基因不含有內(nèi)含子，mRNA加工及時，轉(zhuǎn)錄快速；在應激條件下，除HSPmRNA以外的mRNA都處于非翻譯狀態(tài)，HSPmRNA的翻譯競爭減少。應激時HSP70以高濃度集聚在染色體和核質(zhì)內(nèi)，作為瞬間的細胞基質(zhì)和核基質(zhì)固定細胞，防止染色質(zhì)和mRNA復合物降解[5]。而應激消除后細胞處于恢復階段時，細胞核內(nèi)的HSP70又返回胞漿，并且在細胞漿內(nèi)呈低水平表達，再次應激又重新返回細胞核。

2 早期胚胎中HSP70家族的基因類型和表達規(guī)律

HSP70由HSP70基因家族HSP70-1、HSP70-2、HSP70-Horn、 HSP70B、 HSP70B'、 HSC70、 GRP78、PBP74、SICTH等編碼[6]。HSP70-l和HSP70-2基因的核苷酸有l(wèi)1處差異，2處位于編碼區(qū)，HSP70-1基因為熱誘導表達，在無熱誘導的Hela細胞中有低水平表達。HSP70-2僅限于熱休克狀態(tài)表達，HSP70B基因和HSP70B'基因，為嚴格熱誘導表達，無基礎(chǔ)表達。PBP74可以與抗HSP70蛋白抗體結(jié)合。熱休克蛋白70主要被熱休克因子控制，亦與C2fos、C2myc、p53等基因及鈣/鈣調(diào)蛋白、甘油二酯、磷酸肌醇23激酶、cAMP、PKC等生理因子有關(guān)[7]。

胚胎發(fā)育中合子基因組激活后，熱休克基因最先表達，且具有階段特異性和組織特異性。結(jié)構(gòu)型HSP70在植入前各期小鼠胚胎中均有表達。誘導型的HSP70在胚胎發(fā)育到8-cell期時才能檢測到[8]。HSP68和HSP70在2-細胞期的小鼠胚胎自發(fā)表達，但HSP68的自發(fā)表是暫時的，4-cell期即停止，囊胚期后（含囊胚期）HSP68才能被誘導表達。結(jié)構(gòu)型HSC73通常在神經(jīng)管閉合、神經(jīng)外胚層分化和增殖過程中有較高水平的表達，位于細胞漿和細胞核內(nèi)，參與神經(jīng)元的分化。結(jié)構(gòu)型GRP75和GRP78在胚胎發(fā)育階段也有表達，其中，GRP75定位于小鼠18號染色體[9]。

Christians等[8]證實早在受精卵的單細胞階段即有HSP70-1mRNA的構(gòu)成型表達，在兩個細胞階段達高峰，之后表達減少，直到在胚囊階段成為熱誘導型HSP70-1。誘導型、構(gòu)成型HSP70-2 mRNA在小鼠胚胎中均無表達。在人類的胚胎形成中除了誘導型的HSP70-2/1還有另外1對誘導型的HSP70，即HSP70-6和HSP70-7，他們的序列具有95%的同源性。

3 HSP70對早期胚胎的保護作用

Al-Katanani等[10]在2-細胞牛胚的培養(yǎng)液里加入誘導型的HSP70抗體后發(fā)現(xiàn)2-細胞牛胚發(fā)育到囊胚的百分率降低。Neuer等[11]用抗鼠HSP70單克隆抗體與2-細胞鼠胚共同孵育，在第5天時發(fā)現(xiàn)囊胚孵出率明顯降低，結(jié)果說明，抗HSP70抗體對鼠胚生長產(chǎn)生強抑制作用。Mirkes等[12]發(fā)現(xiàn)過量表達誘導型HSP70的轉(zhuǎn)基因小鼠可以防御由高熱引起的胚胎致死效應。還有很多類似的試驗證明HSP70對胚胎發(fā)育具有保護作用，可能是與HSP70的特殊生物功能有關(guān)。

3.1 HHSSPP7700的分子伴侶作用 在生理條件下，HSP70做為分子伴侶，直接參與蛋白質(zhì)從初生鏈合成到多亞基復合體折疊、裝配的整個生物合成，并參與蛋白質(zhì)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的易位、參與分解錯裝的蛋白等，對調(diào)節(jié)蛋白內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用。哺乳動物胚胎在應激條件下誘導合成大量的HSP70，而其他蛋白的合成暫時停止或減弱。新合成的HSP70通過在胞質(zhì)中識別和結(jié)合某些未折疊的多肽鏈，阻止其不可逆的變性和聚集，同時還促進變性蛋白質(zhì)的降解和清除，重新激活某些酶以維護細胞的功能和生存。應激停止后，HSP70通過ATP供能幫助折疊錯誤的蛋白質(zhì)解開，促進其正確折疊和裝配。

3.2 HHSSPP7700參與細胞增殖 HSC70位于星體、紡錘體及中心體等有絲分裂裝置，在細胞有絲分裂過程中起一定的作用。向雞胚中加入微量抗HSP70的抗體，隨抗體濃度的增加，可破壞有絲分裂裝置，阻斷細胞分裂，干擾細胞分化[13]。在應激情況下，HSPs可作為細胞周期抑制分子的穩(wěn)定劑或細胞周期促進分子的抑制劑對細胞周期產(chǎn)生負性調(diào)控[14]。熱休克蛋白70抗體還能降低精子穿過卵母細胞透明帶的能力，干擾受精卵Ⅱ期減數(shù)分裂和原核的形成。因此，人們利用HSP70的這種特性，研究HSP70在癌癥治療領(lǐng)域的應用，并取得了一定的成果。

3.3 HHSSPP7700與耐熱性 將重組誘導型HSP70基因轉(zhuǎn)入鼠成纖維細胞，發(fā)現(xiàn)HSP70表達增加，成纖維細胞對熱的抗性增加[15]。Browder比較不同發(fā)育階段海膽胚胎熱休克后的發(fā)育狀況，結(jié)果從受精卵到囊胚胎期間的任何階段都未發(fā)現(xiàn)HSP的誘導合成，此期胚胎死亡及異常達99%，但當囊胚期及其以后，熱應激可以誘導HSP合成，胚胎成活及正常發(fā)育率達99%以上[16]。轉(zhuǎn)基因小鼠耐熱性增強，且耐熱性的水平與HSP70的表達水平密切相關(guān)。說明HSP70能夠增加胚胎對熱應激的耐受性，因此，將胚胎在溫和熱環(huán)境下進行熱休克處理后，可以抵抗更大強度的熱應激，提高胚胎在各種熱環(huán)境下得存活率。

3.4 抑制細胞凋亡 已知許多應激原通過激活凋亡途徑從而導致胚胚發(fā)育異常，研究發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)HSP70水平增高可以通過阻斷信號通路，抑制應激誘導的JNK激活，從而減少細胞的凋亡[17]。向培養(yǎng)液中加入熱休克蛋白70抗體后，體外培養(yǎng)的胚胎細胞凋亡增多，囊胚率明顯降低，HSP70還能抑制應激激酶P38的活性。所以，在應激狀態(tài)下，細胞內(nèi)HSP70家族基因表達增加，可抑制應激激酶激活，防止細胞凋亡。HSP72還可通過抑制線粒體細胞色素C的釋放，或直接與細胞內(nèi)細胞色素C結(jié)合，從而阻止caspase的激活，抑制細胞凋亡[18]。HSP70還能抑制氧自由基的產(chǎn)生，直接釋放和增加內(nèi)源性過氧化酶水平，清除氧自由基，減少Ca2+內(nèi)流所引起的細胞毒性和細胞死亡[19]。

4 目前研究早期胚胎中HSP70的常用方法

4.1 誘導胚胎產(chǎn)生HHSSPP7700的方法 最常用的方法是熱應激。

4.1.1 按照熱應激的次數(shù)分 可分為連續(xù)熱應激和單次熱應激。連續(xù)熱應激即每天在固定時間對數(shù)批孕鼠或胚胎（體外）進行不同溫度梯度的熱休克處理，連續(xù)處理數(shù)次，直至預定時間（1-cell期、2-cell期、4-cell期、8-cell期、桑椹胚、囊胚）。然后處死小鼠，取出胚胎，繼續(xù)體外培養(yǎng)或直接對胚胎進行處理。單次熱應激即在胚胎發(fā)育的不同階段，對孕鼠或胚胎（體外）進行一次熱休克處理，然后再恢復至正常條件下，待胚胎繼續(xù)發(fā)育一段時間，再對胚胎進行處理[20-23]。

4.1.2 按照熱應激的對象分 可分為體外熱應激和體內(nèi)熱應激。體內(nèi)熱應激是對母鼠進行熱休克處理（一般是把小鼠放在生化培養(yǎng)箱內(nèi)，設(shè)置預定溫度，熱休克處理一段時間），再將小鼠處死，取出胚胎，進行檢測；或?qū)π凼筮M行一定時間的熱應激后與正常雌鼠交配，檢測胚胎的發(fā)育情況。體外熱應激是將發(fā)育到一定階段的胚胎取出，培養(yǎng)一段時間后，將CO2培養(yǎng)箱溫度調(diào)至一定溫度，熱休克處理一段時間，再恢復至正?；蛉〕雠咛ズ笾苯訉ε咛ミM行熱應激處理。

4.2 胚胎中HHSSPP7700定性、定量和定位檢測 根據(jù)熱休克蛋白70家族具有相似的等電點，在pH梯度膠中等電聚焦將其分離，然后按照熱休克蛋白70家族成員的分子量大小在垂直方向或水平方向進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳第二次分離，凝膠經(jīng)圖像掃描后，用Image Master圖像軟件系統(tǒng)分析[24]。核酸雜交技術(shù)可以證明HSP70基因是否存在待測的核酸而不能證明該核酸分子在細胞或組織中存在的部位[25-26]。原位雜交細胞或組織化學技術(shù)，用特殊標記（放射性同位素標記物或非放射性的標記物）核酸探針（DNA探針、RNA探針、cDNA探針、cRNA探針和寡核苷酸探針等），進行了細胞或組織的基因定位[27]。RT-PCR比Northern印跡或核酸酶保護分析更靈敏，需要的RNA量及序列信息較少，而且還可以對PCR產(chǎn)物進行標記，用于Southern雜交和原位雜交，質(zhì)粒重組，基因轉(zhuǎn)染等后續(xù)試驗[28]。這種方法常用于在胚胎中HSP70的研究。

5 HSP70的研究意義

在早期胚胎發(fā)育時期，細胞的增殖和分化旺盛，基因表達、蛋白質(zhì)合成非?；钴S，在這個時期，研究胚胎中HSP變化和作用，是探討HSP70與胚胎生長發(fā)育和畸形發(fā)生內(nèi)在聯(lián)系的重要途徑。分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展，為從分子水平方面揭示胚胎發(fā)育正常/異常的奧秘開辟一條新的途徑。

[1]Kelley K L,Erdos G W,Hansen P J,et al.Alterations in ultrastructural morphology of two-Cell bovine embryos producedin vitroand in vivoFollowing a Physiologically Relevant Heat Shock[J].Biology of Reproduction,2003,69:2068-2077.

[2]Takaya M,Manabu O,Miho H,et al.Developmental competence and glutathione content of maternally heat-stressed mouse oocytes and zygotes[J].AnimalScienceJournal,2004,75:117-124.

[3]沙偉，劉娣.奶牛早期胚胎死亡原因及分析[J].中國畜牧獸醫(yī)，2005，32（6）：19-21.

[4]Boshoff T,Lombard F,Eiselen R,et al.Differential basal synthesis of hsp70/hsc70 contributes to interindividual variation in hsp70/hsc70 inducibility[J]. Cell Mol Life Sci,2000,57(8-9):1317-1325.

[5]凌明圣.分子伴侶Hsp70研究進展[J].國外醫(yī)學一分子生物學分冊，1993，l5（5）：227-230.

[6]Feige U and Polla NS.Heat shock protein:the HSP70 famliy[J]. Experentia, 1994(50): 979-986.

[7]Luft JC,Dix DJ.HSP70 expression and function during embryogenesis[J]. Cell Stress Chaperones,1999,4(3):162-170.

[8]Christians E,Campion E,Thompson E M.Expression of the Hsp70.1 gene,a landmark of early zygotic activity in the mouse embryo,is restricted to the first burst of transcription[J].Development,1995,121:113-122.

[9]Neuer A,Spandorfer S D,Giraldo P,et al.Heat shock protein expression during gametogenesis and embryogenesis[J].Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology,1999,7:10-16.

[10]Al-Katanani Y M,Hansen P J.Indcued thermotolerance in bovine two-cell embryos and the role of heat shock protein70 in embryonic development[J].Mol Reprod Dev,2002,62:174-180.

[11]Neuer A,Mele C,Liu H C,et al.Monoclonal antibodies to mammalian heat shock proteins impair mouse embryo development in vitro[J].Human Reproduction,1999,13(4):987-990.

[12]Mirkes P E,Correl L M,Wilson K L.Heat shock protein 70(HSP70)protects postimplantation murine embryos from the embryolethal effectsofhyperthermia[J].DevDyn,1999,214(2):159.

[13]于麗，管英俊.熱休克蛋白與胚胎發(fā)育[J].解剖科學進展，2002，8（1）：88-91.

[14]劉臣.熱休克蛋白與細胞周期調(diào)控[J].上海鐵道大學學報，2000，21（11）：70-72.

[15]Anderson R L,Van K I,Kraft P E,et al.Biochemical analysis of heat-resistant mouse tumor cell strains:a new member of the HSP70 family[J].Mol Cell Biol,I989,9(8):3509-3516.

[16]王楓.熱休克蛋白與熱耐力研究進展[J].國外醫(yī)學：衛(wèi)生學分冊，1997，24（2）：65-67.

[17] Mosser D D, Caron A W, Bourgent L. The chapercne function of hsp70 Is required for protection against stress-induned apoptosis[J].Mol Cell Biol,2000,20:7146-7159.

[18]李洪，劉橋義，楊天德.熱休克蛋白的抗凋亡作用[J].國外醫(yī)學臨床生物化學與檢驗學分冊，2000，12（3）：117.

[19]馮剛.應激反應的細胞損傷和抗損傷機制及其調(diào)控[J]. 創(chuàng)傷外科雜志，1999，1（1）：51-53.

[20]Manabu O,Yukiko Y,Miho H,et al.Viability of maternally heat-stressed mouse zygotesin vivoandin vitro[J].Animal Science Journal,2003,74:181-185.

[21]Zhu B,Walker S K,Oakey H,et al.Effect of paternal heat stress on the developmentin vitroof preimplantation embryos in the mouse[J].Paternal heat stress and embryo development,2004,36:384-394.

[22]Zhu Band Maddocks S.The effect of paternal heat stress on protein profiles of pre-implantation embryos in the mouse[J].International Journal of Andrology,2005,28:128-136.

[23]Rivera R,Mand Hansen P J.Development of cultured bovine embryos after exposure to high temperatures in the physiological range[J].Reproduction,2001,121:107-115.

[24]Jesus A G,Vince G J.Chemical modifications of a recombinant bovine stress-inducible 70 kDa heat-shock protein(Hsp7O)mimics Hsp7O isoforms from tissues[J]. Biochem, 1995,305:197-203.

[25]C-H Liu,C-C Yang,DP-C Lin.Stored of Hsp72/Hsp73 in Germinal Vesicle-stage Mouse Oocytes[J].Reprod Dom Anim,2004,39:19-24.

[26]Christine L,Michel T,Robert S.Expression of heat shock protein 70 in normal and cryptorchid human excurrent duct[J].Mol Hum Reprod,2004,10:197-202.

[27]Lee J S,Jeong S S.HSP70 deficiency results in activation of c-Jun N-terminal Kinase,extracellular signal-regulated kinase,and caspase-3 in hyperosmolarity-induced apoptosis[J].Biol Chem,2005,280:6634-6641.

[28]Chandolia R K,Peltier M R,Tian W.Transcriptional control of development,protein synthesis,and heat-induced heat shock protein 70 synthesis in 2-cell bovine embryos1[J].Biology of Reproduction,1999,61:1644-1648.