真菌毒素檢測(cè)技術(shù)研究概述

◎ 李曉丹

（德宏州質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南 德宏 678400）

真菌毒素是由真菌產(chǎn)生的具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛污染農(nóng)作物、食品及飼料等產(chǎn)品。被發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的真菌毒素主要有黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）、 赭 曲 霉 毒 素（ochratoxin，OT）、 橘 霉 素（citrinin）、展青霉素(patulin，Pat)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxvnivalenol，DON）和伏馬毒素（fumonisin）等。真菌毒素的特征主要表現(xiàn)在污染的廣泛性、危害的嚴(yán)重性上。真菌毒素直接的危害是毒素的暴露而引發(fā)急性疾病或許多慢性癥狀，如生長減慢、免疫功能下降、抗病能力差以及腫瘤的形成等。目前，真菌毒素的檢測(cè)方法主要有化學(xué)分析法、儀器分析法和免疫分析法等[1]。

1 主要真菌毒素介紹

1.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素是結(jié)構(gòu)相似的一大類化合物，常由黃曲霉及另外幾種霉素在霉變的谷物中產(chǎn)生，是目前為止最強(qiáng)的致癌物質(zhì)。黃曲霉毒素以AFB1的毒性最強(qiáng)。黃曲霉毒素急性中毒時(shí)，可發(fā)生肝膽病變，嚴(yán)重的甚至可導(dǎo)致死亡；慢性中毒時(shí)表現(xiàn)為致癌性和免疫抑制等作用[2]。Soni P等[8]發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素通過遺傳和非遺傳途徑誘導(dǎo)多種效應(yīng)，從而改變宿主細(xì)胞的功能。AFB1調(diào)節(jié)多個(gè)表觀遺傳調(diào)節(jié)器，結(jié)果顯示AFB1對(duì)多基因表觀調(diào)制的影響是已知的關(guān)鍵致癌過程。主要檢測(cè)方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜、免疫分析法和薄層色譜法[2][6][7]。

1.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素是由曲霉屬和青霉屬的某些霉菌產(chǎn)生的真菌毒素，主要有7種結(jié)構(gòu)類似物，對(duì)人類的健康有影響的主要是OTA、OTB和OTC[3]。赭曲霉毒素是繼黃曲霉毒素之后又一引起世界各國廣泛關(guān)注的真菌毒素，主要出現(xiàn)在谷物、豆類、咖啡、葡萄以及飼料中，由于毒素蓄積殘留，也會(huì)出現(xiàn)在牛奶和肉類中。主要檢測(cè)方法有液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、免疫分析法和薄層色譜法[6][7]。

1.3 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種類雌激素樣真菌毒素。主要污染玉米、大麥、高粱、大米和小米等，其中以玉米的檢出率和含量最高。ZEN具有雌激素，主要作用于生殖系統(tǒng)，可使家畜、家禽和實(shí)驗(yàn)小鼠產(chǎn)生雌性激素亢進(jìn)癥。妊娠期的動(dòng)物食用含有ZEN的飼料可引起流產(chǎn)、死胎和畸胎。主要檢測(cè)方法有液相色譜法、熒光光度法、液相色譜-質(zhì)譜法、免疫分析法[2][7]。

1.4 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇又被稱為“嘔吐毒素”，是鐮刀菌在谷物生長過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物。DON在谷類作物中含量最高，啤酒、雞蛋、牛奶、肉類等農(nóng)副產(chǎn)品也有檢出。其在食品和環(huán)境中廣泛分布，通過食物鏈的傳遞對(duì)人類和動(dòng)物的健康產(chǎn)生巨大威脅。主要表現(xiàn)為嘔吐、消化紊亂等。DON污染引發(fā)的食品安全隱患表現(xiàn)在其污染的廣泛性，此外還有細(xì)胞毒性、免疫毒性、遺傳毒性以及致畸性和致癌性等。主要檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、薄層色譜法、免疫分析法、氣相色譜法[2][6][7]。

1.5 伏馬毒素

伏馬毒素是由鐮刀菌屬在一定溫度和濕度下產(chǎn)生的水溶性代謝產(chǎn)物。伏馬毒素在全球廣泛分布，主要分布在以玉米、高粱、小麥為主的農(nóng)作物上，造成農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止，發(fā)現(xiàn)的伏馬毒素有11種，主要以FB1、FB2、FB33種形式存在，其中以FB1危害范圍最大、毒性最強(qiáng)。伏馬毒素對(duì)植物代謝有毒害作用。伏馬毒素還是一種慢性促癌劑，并能引起靈長類動(dòng)物的動(dòng)脈粥樣硬化。主要檢測(cè)方法有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法[2][5][7]。

1.6 麥角生物堿

麥角生物堿簡稱麥角堿，是由麥角菌屬侵害黑麥、大麥、小麥、裸麥、燕麥等禾本科植物而產(chǎn)生的生物堿毒素。麥角毒素的毒性效應(yīng)主要是外周圍和中樞神經(jīng)效應(yīng)，中毒癥狀表現(xiàn)為壞疽性中毒和痙攣性中毒[2]。主要檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法[2][4]。

1.7 展青毒素

展青毒素又名棒曲霉毒素，是一類由曲霉和青霉等真菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有影響生育、致癌、致畸和免疫等毒理作用，也是一種神經(jīng)毒素。廣泛存在于各種霉變水果和青貯飼料中。主要檢測(cè)方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和免疫分析法[2][3]。

1.8 其他類真菌毒素

1.8.1 橘霉素

橘霉素（Citrinin，CIT）主要由青霉屬、曲霉屬產(chǎn)生，是具有腎毒性、致畸性、致癌性和致突變性的次級(jí)代謝產(chǎn)物。主要檢測(cè)方法有薄層色譜法、免疫分析法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]。

1.8.2 T-2毒素和HT-2毒素

T-2毒素和HT-2毒素是由多種真菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素。T-2毒素具有高毒性，人體吸入時(shí)會(huì)急性中毒。主要檢測(cè)方法有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和免疫分析法[6][7]。

1.8.3 雜色曲霉素

雜色曲霉素（sterigmatocystin）是一類結(jié)構(gòu)類似的化合物，主要由雜色曲霉和構(gòu)巢曲霉等真菌產(chǎn)生，雜色曲霉主要污染谷物，雜色曲霉素主要表現(xiàn)為肝、腎中毒，具有強(qiáng)致癌性。主要檢測(cè)方法有薄層色譜法、高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法、免疫分析法、化學(xué)傳感器分析等[7]。

1.8.4 白僵菌素

白僵菌素（beauvericin，BEA）是鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的六酯肽類真菌毒素，可致畸、致突變等。Mallebrera B[21]等綜述了最新的研究表明BEA是具有遺傳毒性的，產(chǎn)生DNA斷裂、染色體畸變，并通過線粒體途徑參與細(xì)胞凋亡。主要檢測(cè)方法有常規(guī)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法。

1.8.5 鏈格孢霉菌類毒素

鏈格孢霉菌是除曲霉、青霉和鐮刀菌以外的另一種重要的產(chǎn)毒菌。鏈格孢霉菌產(chǎn)生的多種次生代謝產(chǎn)物對(duì)人或牲畜具有誘變性、致癌性和致畸性。鏈格孢霉毒素中目前研究比較有代表性的毒素是AOH、AME和TeA。鏈格孢霉毒素中常用薄層色譜法、氣相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、液相色譜及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)和用于快速檢測(cè)的酶聯(lián)免疫分析[18]。Puntscher H等[25]介紹了一種含有17種毒素的LC-MS/MS方法，用于研究番茄醬、葵花籽油和小麥粉中游離和修飾鏈格孢毒素的自然發(fā)生。所建立的多重分析方法適用于不同食物基質(zhì)中產(chǎn)生鏈格孢毒素。

1.8.6 恩鐮孢菌素

恩鐮孢菌素（enniatins，ENNs）和白僵菌素一樣，是由鐮刀菌屬的某些真菌產(chǎn)生的真菌毒素，目前已發(fā)現(xiàn)了20多種恩鐮孢菌素，食品中最常見的主要 是 ENA、ENA1、ENB、ENB1。Manyes L 等[22]研究Jurkat T細(xì)胞用于研究白僵菌（BEA）和enniatin B（EnNb）的毒性作用。韓小敏等[19][20]對(duì)BEA和ENNs的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述并開發(fā)了同時(shí)檢測(cè)BEA和ENNs的儀器分析方法。主要檢測(cè)方法有常規(guī)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[19]。

2 真菌毒素檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

2.1 薄層色譜法

薄層色譜法（TLC）是真菌毒素的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，樣品經(jīng)提取、濃縮、薄層分離后，在紫外光照射下觀察其熒光特性，定性定量。薄層色譜法操作過程繁瑣復(fù)雜、溶劑消耗大、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員要求高、重現(xiàn)性低、靈敏度低，目前該方法已逐步被其他方法取代。

2.2 氣相色譜法及氣相色譜-質(zhì)譜法

氣相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜法常用于分析熱穩(wěn)定、容易汽化、分子中不含發(fā)色基團(tuán)和熒光基團(tuán)，或具有弱熒光或弱吸收的真菌毒素。真菌毒素中采用氣相色譜法檢測(cè)主要是單端孢霉烯族類化合物，由于待測(cè)目標(biāo)物不易揮發(fā)，樣品經(jīng)凈化處理后需進(jìn)行衍生化將其轉(zhuǎn)化為低沸點(diǎn)的衍生物，較為耗時(shí)費(fèi)力。

2.3 高效液相色譜法及高效液相色譜-質(zhì)譜法

高效液相色譜和高效液相色譜-質(zhì)譜法是目前食品中污染物監(jiān)測(cè)方法中適用范圍最廣泛、使用頻率最高的分析方法。具有穩(wěn)定可靠、靈敏度高的特點(diǎn)，適用于大多數(shù)真菌毒素，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種真菌毒素的定量檢測(cè)。既具備了高效液相色譜的高分辨率，又可以發(fā)揮質(zhì)譜的高鑒別能力，凈化要求低、靈敏度高、可以同時(shí)進(jìn)行多組分分析，能夠同時(shí)鑒別不同種屬的真菌毒素。Jiang K等[16]通過改進(jìn)SPE的吸附劑，同時(shí)進(jìn)行 牛 奶 中 AFB1、AFM1、OTA、ZEA、α-ZOL、β-ZOL的純化和富集，并用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)牛奶中的6種目標(biāo)化合物進(jìn)行檢測(cè)。Carballo D等[23]用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)分析即食食品中27種真菌毒素，包括黃曲霉毒素（B1，B2，G1，G2）、恩鐮孢菌素（A，A1，B，B1）、BEA、FB1、FB2、雜色曲霉素、DON、3-ADON、15-ADON、玉米赤霉烯醇、T-2毒素和HT-2毒素等。該方法成功地應(yīng)用于25份即食食品樣品的分析。真菌毒素主要檢測(cè)在谷物、蔬菜和豆類制備的即食食品樣品中。Shao M等[24]運(yùn)用利用LC-MS/MS研究狗糧中最常見的真菌毒素的發(fā)生情況。

2.4 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜

Jerome Jeyakumar JM等[11]采用高效液相色譜、液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）對(duì)鐮刀菌感染甘蔗進(jìn)行了評(píng)價(jià)。建立了一種簡便、靈敏、可靠的快速檢測(cè)鐮刀菌屬8種真菌毒素的方法：FB1和FB2、DON、尼伐烯醇、3-ADON、15-ADON、ZEN和AFG1。在兩個(gè)主要產(chǎn)物離子的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行了分析。LC/MS和MALDI-TOF MS/MS所產(chǎn)生的結(jié)果揭示了調(diào)節(jié)真菌毒素產(chǎn)生的各種機(jī)制，這有助于闡明敏感和選擇性化合物的作用。

2.5 免疫分析法

免疫分析法是利用抗原抗體反應(yīng)原理對(duì)真菌毒素定性定量檢測(cè)的分析方法，具有簡單、靈敏度高、迅速等特點(diǎn)，可用于真菌毒素的大批量初篩。在真菌毒素檢測(cè)方法中常用的有酶聯(lián)免疫分析法以及近年來發(fā)展比較迅速的免疫膠體金技術(shù)和免疫芯片技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、前處理簡單、易于推廣等優(yōu)點(diǎn)，特別適合大量樣品中真菌毒素的檢測(cè)。但ELISA具有一定的假陽性，在檢出陽性時(shí)需進(jìn)一步確證。

2.6 生物芯片分析法

生物芯片是近年來在生命科學(xué)領(lǐng)域迅速發(fā)展起來的高新技術(shù)，具有大規(guī)模、高通量和高平行的特點(diǎn)，是當(dāng)今世界的前沿學(xué)科和研究熱點(diǎn)。Man Y等[13]綜述了生物芯片在真菌檢測(cè)方面的運(yùn)用。

2.7 其他新型方法

2.7.1 生物傳感器

生物傳感器是基于抗原抗體的高度親和作用，運(yùn)用電化學(xué)科技將毒素的相互作用轉(zhuǎn)換成信號(hào)進(jìn)行測(cè)定。Jalalian SH等[10]研制了一種檢測(cè)AFM1的新型電化學(xué)傳感器。APTASSER允許檢測(cè)AFM1，檢測(cè)限為0.9 ng/L。APTASSER傳感器成功地應(yīng)用于實(shí)際樣品中AFM1的檢測(cè)，包括牛奶和血清樣品。Ma C等[12]描述了一種熒光檢測(cè)OTA，該方法對(duì)OTA具有高度選擇性。生物傳感器法目前處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

2.7.2 核酸適配體

基于適體的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換特性，Li Y[9]等報(bào)道了適配體熒光法檢測(cè)AFB1。AFB1的檢出限達(dá)到0.2 nm。該方法能夠檢測(cè)復(fù)雜樣品基質(zhì)中的AFB1，例如稀釋的葡萄酒樣品和玉米粉樣品。這種基于適體的熒光法測(cè)定AFB1具有廣闊的應(yīng)用前景。核酸適配體主要是基于核苷酸識(shí)別原件，同抗體比較具有差異小、純度高、性質(zhì)穩(wěn)定、耐高溫等優(yōu)勢(shì)，目前并沒有商品化的核酸適配體，但是憑借其眾多明顯優(yōu)勢(shì)，有望在真菌毒素快速檢測(cè)方面發(fā)揮作用。

2.7.3 光波導(dǎo)模式譜

Adányi N[14]等運(yùn)用光波導(dǎo)光模式光譜（optical waveguide lightmode spectroscopy, OWLS）應(yīng)用于競爭AFB1的檢測(cè)，通過增加金的固定表面來增強(qiáng)信號(hào)表面。制備不同尺寸和來源的納米顆粒（通過化學(xué)或生物技術(shù)合成），觀察了AuNPS中粒徑、方法和生化參數(shù)對(duì)免疫傳感器性能的影響。在優(yōu)化敏化傳感器表面后，采用免疫傳感法對(duì)辣椒紅色素中的黃曲霉毒素進(jìn)行了分析，并與HPLC測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。

2.7.4 分子印跡聚合物分析

ELISA已被用于監(jiān)測(cè)FB1的食品和動(dòng)物飼料污染的標(biāo)準(zhǔn)工具。ELISA并不總是有效的，因?yàn)榭贵w和酶組分在免疫分析中的不穩(wěn)定性、樣品中天然酶抑制劑的存在和非特異性蛋白結(jié)合的高水平。此外，由于動(dòng)物在制造過程中的參與，ELISA抗體的生產(chǎn)可能耗時(shí)和昂貴。為了克服這些限制因素，已經(jīng)開發(fā)了分子印跡納米粒子為基礎(chǔ)的分析（Molecularly imprinted polymer nanoparticle-based assay, MINA），Munawar H等[15]設(shè)計(jì)分子印跡納米顆粒（NANOMIP）取代在競爭ELISA中使用的一級(jí)抗體。在樣品中測(cè)定是高度特異性的，并且不與其他真菌毒素（FB2、AFB1、CTT、ZEA和DON）交叉反應(yīng)性。

3 結(jié)語

真菌毒素具有毒性并且廣泛分布，對(duì)人類和家畜造成危害。本文就目前主要造成危害的真菌毒素進(jìn)行了簡介，并闡述了目前常用的真菌毒素檢測(cè)方法及進(jìn)展。對(duì)真菌毒素的檢測(cè)主要集中于快速檢驗(yàn)的篩查技術(shù)以及多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)，隨著真菌毒素檢驗(yàn)技術(shù)研究的進(jìn)一步深入，食品安全性將得到更好的保障。