豆豉纖溶酶的研究進展

◎ 高 洋，孫 艷

（漯河食品職業(yè)學(xué)院，河南 漯河 462300）

豆豉是一種常見的大豆發(fā)酵制品。大豆中除含有優(yōu)質(zhì)的植物蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)外，還含有一定的生理活性物質(zhì)，如大豆異黃酮、大豆低聚糖、大豆皂苷及大豆磷脂等。經(jīng)過發(fā)酵制備的豆豉，其蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)（鈣、鐵）、維生素（B2、PP、E）、纖維素含量均有明顯的提高[1]。在發(fā)酵過程中會產(chǎn)出一種活性較高的酶，稱為豆豉纖溶酶，這種酶不但具有較強的溶解能力，而且安全，對人體無毒害作用，不會引起內(nèi)出血，可以有效預(yù)防血栓的形成[2]，這對于血栓病保健食品的開發(fā)，具有重要意義。

1 豆豉纖溶酶的功能特性

1.1 溶血栓特性

為了探究豆豉纖溶酶是否具有體外溶栓作用，李江偉等[3]用豆豉纖溶酶、尿激酶進行體外試驗。在相同試驗條件下，比較兩種物質(zhì)對血塊的溶解速率，發(fā)現(xiàn)作用2 h后，豆豉纖溶酶血塊溶解率大于50%，尿激酶血塊溶解率為45%；作用6 h后，豆豉纖溶酶血塊溶解率為100%，尿激酶血塊溶解率為75%。由此可見，在體外豆豉纖溶酶比尿激酶的溶栓效果更好。

為了驗證將豆豉纖溶酶作用于體內(nèi)是否也具有較好的溶栓效果，劉宇峰[4]以家兔為對象，分別用豆豉纖溶酶、尿激酶和蚯蚓激酶進行體內(nèi)試，結(jié)果表明：尿激酶對家兔體內(nèi)的動脈血栓無任何作用；蚯蚓激酶劑量為150 mg/kg時，對家兔體內(nèi)的動脈血栓亦無抑栓、溶栓作用；而豆豉纖溶酶劑量為150～300 mg/kg時，具有明顯的抑制動脈血栓形成及溶解血栓作用。同時，他還對豆豉纖溶酶的安全性進行了試驗，研究發(fā)現(xiàn)，對多組家兔灌胃0.05～0.8 g/mL的豆豉纖溶酶時，均無明顯毒性表現(xiàn)，說明了豆豉纖溶酶的安全性。

1.2 抗氧化性

人體內(nèi)的氧化離不開人體和食物中的氧自由基和其他種類的氧原子。這些自由基可以和人體組織、細胞中的氧化活性分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致氧化損傷。豆豉中存在較多的抗氧化物質(zhì)，這些物質(zhì)的抗氧化活性顯著高于未經(jīng)發(fā)酵的大豆。段智變等[5]從納豆中得到一些粗提物，并進行試驗。研究發(fā)現(xiàn)，這些粗提物可以降低機體血清中低密度脂蛋白膽固醇的含量，提高抗氧化酶SOD的活性，從而增強機體的抗氧化作用，減少細胞的氧化損傷。

1.3 降血脂特性

血液中的脂類主要有膽固醇、甘油三酯、磷脂、游離脂肪酸等，其中膽固醇、甘油三酯為疏水性物質(zhì)，不能在體內(nèi)直接轉(zhuǎn)運，也不能被組織細胞直接作用，必須與特殊的蛋白和極性類脂（如磷脂）形成親水性的脂蛋白，才能在機體內(nèi)運輸，并進入細胞，在正常情況下，人體血脂的合成、分解處于動態(tài)平衡之中。血脂過多，會沉積在血管壁上阻塞血管，引發(fā)血栓、動脈粥樣硬化等疾病。而在脂蛋白的代謝中，有兩種非常重要的蛋白質(zhì)——低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL），分別有促進、減緩脂蛋白合成的作用，所以控制高血脂癥的關(guān)鍵在于促進機體HDL的生成。為了研究豆豉纖溶酶與降血脂之間的關(guān)系，袁淑云[6]對正常小鼠進行試驗，將小鼠分為正常組和對照組，試驗組喂食納豆激酶粗提液，在相同條件下，觀察小鼠血脂的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，8%的納豆激酶比正常對照組，使小鼠血清中膽固醇減少了0.54 mg/mL，因此，納豆激酶粗提液在高脂飲食誘發(fā)的小鼠高脂血癥過程中有阻止膽固醇升高的作用。

2 豆豉纖溶酶的制備工藝研究

豆豉纖溶酶的制備包括發(fā)酵菌種的篩選、發(fā)酵、分離純化3個關(guān)鍵工藝。

2.1 菌種的篩選

大量的研究表明，產(chǎn)出豆豉纖溶酶的菌種為枯草芽孢桿菌。董明盛[7]等從豆豉中分離得到豆豉纖溶酶，產(chǎn)酶菌株為枯草芽孢桿菌，其產(chǎn)酶活力達到683.3 U/mL。中國科學(xué)院的韓潤林[8]從豆豉中分離得到1株高產(chǎn)纖溶酶的枯草芽孢桿菌菌株，純酶的比活力達到9800 U/mg，活性回收率為63．8%。東北林業(yè)大學(xué)的王開敏[9]從豆豉中分離到1株有纖溶酶活性的菌種，經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌，并對該菌株的產(chǎn)纖溶酶基因進行克隆表達，得到了能發(fā)酵產(chǎn)胞外纖溶酶的重組體。

2.2 豆豉纖溶酶的發(fā)酵

傳統(tǒng)的豆豉纖溶酶發(fā)酵工藝可分為固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩大類。固體發(fā)酵是先將大豆煮熟，接種上相應(yīng)的菌種，培養(yǎng)后即可得到豆豉纖溶酶，此種方法操作簡單、周期短、生產(chǎn)成本低。而液體發(fā)酵則是在液體培養(yǎng)基的環(huán)境下，接上菌種進行發(fā)酵的方法。液體發(fā)酵的條件更易控制，適合工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)，是目前生產(chǎn)豆豉纖溶酶的主要發(fā)酵方法。

近年來，又發(fā)現(xiàn)了一種新的發(fā)酵技術(shù)——雙水相發(fā)酵，其中菌體底物為一相，產(chǎn)物為一相，該種方法能將發(fā)酵過程中的生物轉(zhuǎn)化與分離相結(jié)合，與傳統(tǒng)的發(fā)酵手段相比，更快速、簡便，而且還能解除發(fā)酵產(chǎn)物中的反饋抑制現(xiàn)象，生成的物質(zhì)穩(wěn)定、成本更為低廉，適合工業(yè)上的連續(xù)生產(chǎn)。

同時，也能利用生物克隆技術(shù)獲得豆豉纖溶酶。張少平等[10]利用生物克隆技術(shù)將原豆豉纖溶酶的DNA片段復(fù)制克隆到載體pET32a中，并將這樣的重組體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中，以此在大腸桿菌內(nèi)獲得豆豉纖溶酶蛋白酶。Liang等[11]利用Lactococcus lactis菌株，將NK的片段基因?qū)肫渲?，從而成功獲得了豆豉纖溶酶的受體菌株。

2.3 豆豉纖溶酶的分離純化

豆豉纖溶酶進行分離純化的關(guān)鍵是保證酶的活性、純度及得率，同時，由于纖溶酶的熱敏感性，導(dǎo)致極易發(fā)生自溶現(xiàn)象[12]，其在進行分離純化時，整個過程通常會處于低溫狀態(tài)下。此外，由于微生物可以分解豆豉纖溶酶，其整個分離純化過程還應(yīng)注意其他菌種的污染，避免造成分離后的豆豉纖溶酶活力不穩(wěn)定[13]。

目前，豆豉纖溶酶的分離純化方法主要有硫酸銨沉淀法、超濾、凝膠過濾、層析等。王金英等[14]人利用硫酸銨沉淀法實現(xiàn)了豆豉纖溶酶的分離純化，其前處理為將豆豉加入到一定比例的生理鹽水中，放置于10 ℃的環(huán)境下不斷攪拌10 h，之后使用離心機進行離心，將離心后的上清液裝入特定的容器中，再加入硫酸銨至飽和度60%，使用攪拌器將改溶液攪拌均勻，在2～8 ℃的環(huán)境下放置10 h。之后進行離心，將離心后的底部沉淀，過透析脫鹽，再對溶液進行離心，所得上清液就是豆豉纖溶酶的粗酶液。

李江偉等[15]利用層析方法對豆豉纖溶酶進行分離純化，其前處理為將豆豉制備成凍干品，之后使用磷酸鹽緩沖液進行酸堿調(diào)節(jié)使溶液中的pH為7.4，再過Sephadex G-100層析柱，并使用該磷酸鹽緩沖液對層析部分進行沖洗280 nm處，并進行收集。以此來獲得豆豉纖溶酶的粗酶液。

韓潤林等利用超濾對豆豉纖溶酶進行了分離純化。其前處理為先將豆豉發(fā)酵液進行去除雜菌，再加入無水CaCl2，維持pH為6.6，之后進行離心處理，獲取上清液。將所得的上清液進行超濾脫鹽處理得到濃縮液，并對其進行層析分離。之后再對活性部分進行沉淀、離心、層析處理，獲取其活性部分，即為溶栓酶。對其進行酶活力的測定，發(fā)現(xiàn)其均有較高的酶活。

3 豆豉纖溶酶的應(yīng)用前景

目前，功能性食品作為新興產(chǎn)業(yè)，其自身的功能作用越來越受到大眾的關(guān)注，并且隨著現(xiàn)代人保健意識的提高，對于食療好于藥療的觀念在逐漸增強，這些功能性食品也逐漸走進普通大眾的生活，深的人們喜愛。同時腦栓作為危害人類的十大疾病，給人們的生活帶來極大困擾。因此，利用豆豉纖溶酶極好的溶栓效果，來開發(fā)對于的功能性食品，對人類的生活乃至生存都具有及其重要的意義。