微環(huán)境對牙髓血運重建的影響研究

梁 倩，于鳳麟，趙月萍

(1.暨南大學口腔醫(yī)學院，廣東 廣州 510632；2.暨南大學細胞生物系/生物醫(yī)藥研究院，廣東 廣州 510632)

牙髓組織是包括有各種細胞，纖維，血管，神經(jīng)的一個完整的器官組織。當恒牙發(fā)育期間受到創(chuàng)傷、炎癥等引起牙髓感染壞死時，會使牙根發(fā)育停止，此時患牙牙根短，冠根比例不協(xié)調，根部牙本質壁薄弱易折裂等，在口內的使用質量和壽命都將受到影響 。傳統(tǒng)的治療方法是根尖誘導術，通過根尖屏障使根尖孔閉合。不過存在部分患牙牙根不能繼續(xù)發(fā)育，牙根短、根管牙本質壁薄受力易折等不足，牙髓血運重建術(revascularization)可以彌補根尖誘導愈后的不足，并有可能再生牙髓-牙本質復合體。

牙髓血運重建術有三大關鍵因素：控制感染 、形成血凝塊與封閉冠部。通過此三步操作形成了一個牙髓腔內細胞賴以生存的環(huán)境，即“微環(huán)境”，直接影響到血運重建術的成功與否。如果發(fā)生根管再感染，或者血凝塊形成不足，牙髓微環(huán)境重建不善會導致血運重建術的失敗[1-2]。牙髓“微環(huán)境”，通俗的講就是指牙髓內細胞生存的微觀環(huán)境，包括細胞外基質以及其中的一些體液成分。只有穩(wěn)定的微環(huán)境才能保證細胞/干細胞的正常增殖、分化、代謝和功能活動。牙髓腔內的多種細胞、神經(jīng)、血管，淋巴和結締組織共同組成了牙髓，其再生的能力取決于干細胞或祖細胞的潛能和微環(huán)境的影響。創(chuàng)傷或感染破壞牙髓組織微環(huán)境的平衡，干擾干細胞增殖分化，促進干細胞凋亡，最終導致牙根停止發(fā)育。血運重建術基于創(chuàng)造一個利于干細胞生存的無菌的微環(huán)境的理念，通過刺激根管內出血形成血凝塊，利用干細胞歸巢作用誘導根尖周組織的干細胞進入根管，在生長因子和血凝塊等搭建的微環(huán)境內使得干細胞增殖分化，促進組織新生，最終達到牙髓再生的目的。但是血運重建術只能得到類牙髓樣組織，沒有真正意義上的牙髓組織[3]。隨著生物技術發(fā)展和醫(yī)療手段的進步，血運重建術從引導組織再生(guided tissue regeneration,GTR)向采用組織工程(tissue engineering)技術發(fā)展，以期獲得具有完整組織功能的牙髓，這也是目前再生性牙髓治療(regenerative endodontics procedures，REPs)的發(fā)展方向和研究熱點。本文查閱了近10年血運重建術的報導，綜述了微環(huán)境在血運重建術中的重要作用，并對牙髓再生新技術進行了展望。

1 血運重建術的發(fā)展歷程

早在二十世紀六七十年代，Ostby首次利用血凝塊促進根管愈合[4]。他對牙髓壞死的年輕恒牙，用4%甲醛消毒，刺激根管出血，形成血凝塊，術后隨訪患牙的臨床癥狀消失，影像學檢查根尖孔閉合。1966年Rule和Winter考慮到根管內感染為厭氧菌為主的混合感染，采用多聯(lián)抗生素(多粘菌素B硫酸鹽、硫酸新霉素、桿菌肽、制霉菌素)和可吸收的碘仿匯合控制根管感染，但不刺激根管出血，文章報導了5個案例，只有1例牙根繼續(xù)發(fā)育，有4例沒有成功。1996年Hoshino首次提出采用三聯(lián)抗生素(triple antibiotic paste，TAP)來控制根管感染，通過藥敏試驗和細菌復蘇實驗，對不同濃度TAP的抗菌性能進行研究，結果發(fā)現(xiàn)TAP在20 μg/ml、50 μg/ml時，細菌數(shù)目為零。2000年Iaway 報道了現(xiàn)代血運重建的病例，對于牙髓壞死的年輕恒牙不預備根管，僅用大量5%NaClO和3%H2O2沖洗根管，然后根管內封兩聯(lián)抗生素(double antibiotic paste，DAP)來控制感染，6周后發(fā)現(xiàn)根管口有牙本質橋的形成。隨后用玻璃離子和樹脂雙層充填。30個月后的隨訪顯示髓室和根管的空間減小，治療獲得成功。此后血運重建操作不斷完善和規(guī)范，2001年至今pubmed輸入“pulp revascularization”檢索有212篇文獻報道，表明血運重建得到了廣泛的認可和應用。2013年學者Diogenes首次提出了標準操作流程，經(jīng)過臨床不斷探索 修正和完善，美國牙髓病協(xié)會(American Association of Endodontics,AAE)于2013年發(fā)布了完整的操作指南，目前最新為2016年版。

血運重建為牙髓壞死的年輕恒牙提供了新的治療思路，大量的動物和人類研究證實它使得牙根繼續(xù)發(fā)育，牙根增加長度和根管壁增加厚度，相比較于根尖誘導和根尖屏障術來說，是目前最好的治療手段，但是它也有失敗的案例，比如血凝塊形成不足導致的失敗，術后根尖未繼續(xù)發(fā)育等問題[1，2，5]。因此如何提高血運重建的成功率是我們亟待解決的問題。

2 無菌的微環(huán)境和組織再生

血運重建術簡單分為以下三個操作：①清理感染牙髓：不預備根管，大量有效的根管沖洗，干燥后根管封抗菌藥物，然后冠部封閉；②檢查患牙無癥狀，用小號銼超出根尖孔，刺激根尖周血液進入根管，然后冠部嚴密封閉，以防微滲漏；③隨訪及預后評估，其中的感染控制和冠部封閉為牙髓腔創(chuàng)造了一個無菌的微環(huán)境。

組織再生必須是在感染控制下的微環(huán)境內才能發(fā)生，因此對于牙根未發(fā)育完全的年輕恒牙，感染控制和冠部的封閉非常有必要。未發(fā)育完成的年輕恒牙主要通過化學消毒和根管封藥來控制感染，不建議根管預備，因為預備根管不僅會繼續(xù)削弱薄的牙本質壁，增大受力根折的風險；還會破壞存在于根尖區(qū)的干細胞，清除掉參與再生過程中分泌重要的生長因子的組織成分[6]。根管常用的沖洗液是次氯酸鈉和乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，TAP/DAP和氫氧化鈣(calcium hvdmxide，CH)是根管內常用封藥。

次氯酸鈉是目前臨床使用最多的一種根管沖洗劑，能夠較強地溶解牙髓壞死組織和根管玷污層中的有機物，推薦的使用濃度從0.50%～5.25%不等，其濃度與細胞毒性正相關。Asrary體外研究不同濃度次氯酸鈉過牙髓細胞活性的研究發(fā)現(xiàn)當次氯酸鈉的濃度由0.04%上升至0.08%，細胞活性下降30倍，因此他認為高濃度的次氯酸鈉對干細胞有細胞毒性[7]。另一對1.25%次氯酸鈉沖洗液和TAP的研究發(fā)現(xiàn)，僅用1.25%次氯酸鈉沖洗根管只有10%的根管無菌，而根管封藥TAP兩周后，剩余90%的根管里細菌為0[8]。這說明了根管內起到抗菌主要作用的是TAP，因此在考慮盡可能地保持干細胞的活性情況下，可以選擇低濃度的次氯酸鈉大量的沖洗。

EDTA是一種強效螯合劑，可與次氯酸鈉溶液聯(lián)合使用。17%的EDTA沖洗劑不僅可以去除牙本質中的有機物和無機物，以及牙髓組織中的部分無機物成分，還可清除牙本質玷污層并開放牙本質小管，提高沖洗劑及根管內封藥的療效，還可以使促進細胞募集，增殖分化的細胞釋放細胞因子，提高再生治療的成功率[9-11]。Asgary研究證實5.25%次氯酸鈉對干細胞有毒性，但是17%EDTA可以起到誘導干細胞存活的作用[7]。Galler研究了次氯酸鈉和EDTA對牙本質小管的作用，實驗分兩組，一組只用6%的次氯酸鈉清理牙本質，一組6%的次氯酸鈉和17%EDTA聯(lián)合使用。DPSC接種到含有生長因子和處理過的牙本質壁的水凝膠，植入免疫缺陷鼠的皮下，六周后免疫組化結果示：單獨次氯酸鈉組牙本質璧上可見吸收間隙，而聯(lián)合組可見細胞表面與牙本質壁親密接觸，細胞突起延伸至牙本質小管內和牙本質細胞樣表型表達[12]，說明了17%EDTA可以逆轉次氯酸鈉對干細胞的毒性作用。

根管封藥以控制感染但不損傷干細胞活性為目的，常用的藥物是TAP/DAP或CH。Sabrah體外實驗研究了不同濃度TAP和DAP的抗菌性和細胞毒性作用，分別對糞腸球菌建立的細菌生物膜和牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)處理3 d，結果顯示TAP、DAP在濃度為10、1、0.5、0.25、0.125 mg/ml時，均有抗菌作用，但只在0.125 mg/ml對DPSC無細胞毒性作用[13]。AAE推薦的使用濃度為0.01～0.1 mg/ml[14]。CH同樣是根管封藥選擇之一。2012年Chen研究20例牙髓壞死的年輕恒牙封藥CH血運重建的效果，其中平均隨訪時間19.6月內15例患牙影像學顯示牙根得到進一步發(fā)育，證實氫氧化鈣對根尖乳頭干細胞無毒性。2015年 Galler KM[10，12]報道指出EDTA沖洗根管后再使用CH對生長因子的釋放起到積極作用。

但是，TAP或CH也各有不足，研究證實米諾環(huán)素引起牙體變色，可用阿莫西林、克林霉素等替代。TAP還存在對干細胞的毒性[10]、誘導耐藥菌株產(chǎn)生、發(fā)生過敏反應等和降低牙本質機械性能等不足[15]。學者研究CH易被炎癥吸收、形成不規(guī)則鈣橋和破壞牙本質膠原纖維易引起根折等缺點[16]。

冠部封閉常采用雙層或者三層封閉，以防微滲漏引起根管再感染造成治療失敗[17]。常選擇生物相容性好的材料如三氧化物聚合體(mineral?trioxide?aggregate，MTA)覆蓋血凝塊上。鑒于MTA會引起牙變色，新一代的生物陶瓷材料，主要成分包括氧化鋯、氧化鉭、磷酸二鈣、硅酸鈣等，可以完善封閉根管系統(tǒng)與其周圍組織的交通支，與周圍組織相容性好適用范圍與MTA 相同。

由上可見，不同種類和不同濃度的沖洗試劑和抗生素可以控制感染，為細胞營造一個無菌的環(huán)境外，還可以影響干細胞/細胞的活性。此外在感染環(huán)境下牙髓腔內還會有產(chǎn)生系列的炎癥因子。

最近的證據(jù)表明[18]，感染對于組織創(chuàng)傷修復是把雙刃劍，炎性反應初期刺激受損組織釋放信號因子，使大量干細胞聚集在受損部位，促進組織自我修復；隨著炎性反應的發(fā)展，組織再生受到限制。在牙髓炎早期，炎性反應水平低，細胞因子處于相對低的濃度水平，該濃度下的促炎因子如腫瘤壞死因子(tumor necyosis factor，TNF)、活性氧類(reactiveoxygen species，ROS)，能上調某些信號通路如P38MAPK 信號，促進干細胞分化和礦化過程，以及牙本質涎蛋白(dentin sialoprotein，DSP)和牙本質磷蛋白(dentin phosphor protein，DPP)的表達[19]，隨著炎癥的發(fā)展，干細胞長期暴露于炎癥信號分子，如TNF-α、IL-1、IL-6等，破壞了干細胞的微環(huán)境，干擾干細胞增殖、分化能力，甚至引起干細胞凋亡，導致牙根的發(fā)育停止[3]。

3 根管內微環(huán)境與血凝塊

當患者第二次復診，患者癥狀消失，生理鹽水去除根管抗生素封藥，17%EDTA蕩洗根管，紙尖干燥。選擇10號K銼出根尖孔，刺激根尖周組織出血，使血液進入充滿根管至釉牙骨質界下3～4 mm,血凝塊凝固需要15 min。

2015年，Park報道兩例血運重建不成功的病例：①病例一：患者男，8歲，診斷右下頜第二前磨牙牙髓壞死伴根尖周膿腫，根尖片示：根尖孔開放，根尖周有較大的低密度影?？紤]根尖孔開放，經(jīng)患者及家屬知情同意，對患牙做血運重建。首診2%的利多卡因(含1∶100,000腎上腺素)局部麻醉，橡皮障隔離，5.25%次氯酸鈉沖洗和生理鹽水沖洗根管，封TAP(甲硝唑+環(huán)丙沙星+阿莫西林1∶1∶1生理鹽水調拌)Cavit暫封。三周后復診，患牙無癥狀，去封，生理鹽水沖洗，17%EDTA蕩洗根管。紙尖干燥，10號K銼出根尖孔刺激出血，MTA封閉，放置濕潤的小棉球，暫封，1 d后取出棉球，復合樹脂充填。隨訪1年觀察：患牙無癥狀，根尖周陰影消失，根尖孔閉合，可見牙周膜間隙。但是未見牙根繼續(xù)發(fā)育。②病例二：患者女，20歲，右下頜第二前磨牙診斷牙髓壞死的根尖周膿腫，根尖片檢查根尖孔開放，根尖周低密度影。處理同上，1年后隨訪檢查根尖孔關閉，可見牙周膜間隙，但是牙根未見增長，根管壁未見增厚。

上述病例一失敗原因可能是形成血凝塊不穩(wěn)定，MTA擠壓血凝塊過多根管空間，根管內血凝塊的不足限制了牙根的進一步發(fā)育。病例二的原因是根尖孔的直徑小血凝塊形成不足。由上述案例報導可見血凝塊的形成及性狀在血運重建術中起到了非常重要的作用。血凝塊實際上是一個含有大量生長因子、吸引干細胞募集的三維支架，維持了干細胞增殖、生長和分化所需要的微環(huán)境，對牙髓再生意義重大。

血凝塊的形成與兩個因素有關，一個是要選擇不含腎上腺素局部麻醉藥物，另一個是患牙根尖直徑至少>1.1 mm或1.5 mm[20-21]，根管口>3.2 mm[22]或<0.8 mm[23]無法得到足夠并穩(wěn)定的血凝塊。在血凝塊上放置膠原水凝膠等可以幫助固定血凝塊。Jang研究了膠原膜對寬大根管血運重建的作用，將46個根尖孔均>2 mm的患牙分為兩組，試驗組在根中1/3處血凝塊上放置Bio-Gide膠原膜，其上再放MTA，對照組只在根中1/3血凝塊上放MTA。平均隨訪時間8～28個月，發(fā)現(xiàn)放置膠原膜的根中1/3牙本質壁的厚度有統(tǒng)計學差異，表明膠原膜穩(wěn)定了寬大根管血凝塊的定位，促進牙本質的發(fā)育[24]。

血凝塊形成后，誘導了根尖周血管內干細胞向血凝塊遷移，并募集在血凝塊周圍，此現(xiàn)象被稱為干細胞歸巢(stem cells homing)。這些募集的機體自身干細胞都不同程度地參與了創(chuàng)傷愈合和組織再生的過程。血凝塊也可以認為是一個干細胞龕(stem cell niche)，包含有各種復雜成分如其他的干細胞、基質細胞、免疫細胞、生長因子、黏附因子等其他活性因子、細胞外基質和神經(jīng)纖維等。2011年Lovelace等發(fā)現(xiàn)刺激出血后根管內有CD105、CD13、STRO-1高表達的干細胞，他們認為這些干細胞來自于根尖周組織，進入根管的血液中干細胞的含量是根尖周血液的700倍[25]。研究發(fā)現(xiàn)位于根尖周血管周圍的干細胞有：根尖乳頭干細胞(stem cells form the apical papilla,SCAP)，牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs))，骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)，還有根管殘髓里的DPSCs。Hargreaves證實進入根管的干細胞主要是SCAP[26]，不過因為根尖孔敞開的解剖結構，也有PDLSCs和BMMSCs[26]進入根管。另外動物實驗證實即使牙髓壞死的根尖周病變，根管內也還有部分牙髓有活力，這些組織中含有的DPSCs血運重建后繼續(xù)存在根管內，易被誤為真正的牙髓再生[27]。

干細胞的分化與所處的微環(huán)境密切相關。如果干細胞離開了特定的龕，其生物學行為將由新的微環(huán)境改變。因此干細胞的分化與所處的微環(huán)境密切相關。血凝塊形成后，含有大量的生長因子，如血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor，PDGF)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。它在創(chuàng)傷修復的早期可以促進血管愈合并招募干細胞促進其增殖，但不參與干細胞的分化[28]；PDGF可以促進根尖牙乳頭干細胞的增殖，同時能促進細胞外基質的表達，還能提高細胞耐受凋亡的能力，PDGF還可以促進體外培養(yǎng)的牙乳頭干細胞增殖，抑制其堿性磷酸酶(alkline phosphatase，ALP)的活性，即PDGF可能參與調節(jié)根尖牙乳頭干細胞向成牙本質細胞的分化。另一方面牙本質基質也釋放了大量的生長因子：如轉化生長因子beta 1(transforming growth factor beta 1,TGF-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP - 2)或成纖維細胞生長因子2(fibroblast growth factor 2，β-FGF)[29-30]。 這些因子是間充質干細胞向牙本質細胞分化參與牙本質形成的重要調控因子。其中BMP-2可以調節(jié)干細胞的牙源性分化，促進新生基質的礦化。VEGF對SCAP或DPSCs牙源性分化能力起協(xié)同作用[31]。對牙本質壁表面進行清理，可促進牙本質基質中生長因子的釋放[32]。

大多數(shù)的動物和人類實驗強調了血凝塊的重要性是因為血凝塊里含有的細胞基質、纖維蛋白、趨化因子和生長因子等，共同構建了一個干細胞向牙髓樣組織分化的微環(huán)境。 因此血運重建能否創(chuàng)建一個有益于干細胞分化成牙髓樣組織的微環(huán)境是血運重建術成功的重要影響因素。但遺憾的是目前大量的組織學研究證明新生的組織主要是類骨樣，類牙骨質樣或類牙周樣組織，沒有明確的研究顯示形成了類牙髓組織[27，33]。

為得到完整組織結構和功能性的牙髓組織，組織工程技術被引進到牙髓再生領域。搭載或未搭載有干細胞/細胞的三維支架材料，復合或未復合生長因子和趨化因子，被植入到牙髓腔內誘導牙髓組織的形成。目前支架材料分來天然材料、人工合成材料和復合材料。天然材料如血小板富集血漿(PRP)、膠原、殼聚糖、血凝塊等，它們具有良好的生物相容性和生物降解性。Bezgin研究發(fā)現(xiàn)，濃縮血小板豐富的血漿 (cPRP)在治療根尖病變和開放性頂點時有重要作用[34]。在臨床實際操作中，還存在根管無出血的情況，在沒有血凝塊形成的情況下可用富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)或富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)代替血凝塊，也能達到同樣的治療效果[35]。Bezgi報道了使用富集血小板血漿(platelet-rich plasma，cPRP)治療牙髓壞死的未成熟牙齒治療的兩個病例，12月后隨訪患者無癥狀，影像學顯示牙根進一步發(fā)育，作者認為cPRP用于成功治療牙根未發(fā)育完成的根尖病變的血運重建的支架材料[36]。另有病例報道指出，PRP支架的治療可以改善和加速未發(fā)育完成的牙根的進一步發(fā)育[37]。目前很多病例報道和動物實驗研究PRP和PRF代替血凝塊支架，Mittal[37]認為兩者支架都可以加速組織的新生，Narang[38]研究認為PRF在根尖孔閉合和增加根長和根管壁厚度方面較PRP和血凝塊好。人工合成支架主要是丙交酯乙交酯共聚物，如聚乙交酯、聚L-丙交酯或兩者的共聚物。常用的還有羥磷灰石-磷酸三鈣和釉基質蛋白。

生長因子則誘導促進干細胞增殖和分化。大多數(shù)生長因子通用并可刺激干細胞分化，部分具有特異性，專門幫助誘導分化某些特定的細胞類型。牙本質牙髓再生研究涉及的生長因子主要有TGF、BMP、VEGF、FGF和牙本質基質蛋白等。干細胞根據(jù)其來源分為牙源性和非牙源性。牙源性干細胞主要有以下五種：DPSCs、SCAP、牙胚細胞(germ cell)、乳牙干細胞(stem cell form human exfoliated deciduous teeth,SHED)和牙囊干細胞(dental follicle progenitor cells,DFPCs),其中牙髓干細胞最為關注，研究證實SCAP更適合用于以細胞為基礎的牙髓再生，尤其是進行以再生牙根為目的的牙髓再生。將體外擴大培養(yǎng)的DPSCs、SHED和SCAP通過支架分別植入大鼠皮下和豬的牙槽窩中，有牙本質牙髓復合物(dentin-pulp?complex，DPC)形成[39-40]；非牙源性干細胞主要有BMMSC、胚胎干細胞(embryonic stem cell)、神經(jīng)嵴干細胞(neural crest stem cell)和毛囊干細胞(hair follicle stem cell)等，研究證實骨髓間充質干細胞、脂肪來源的間充質干細胞也能形成牙髓樣組織[41]。

然而目前組織工程技術還只是處在研究發(fā)展階段，雖有眾多的生物材料可供選擇，但均未有牙髓牙本質復合體再生，距功能性牙髓再生還有很長的路要走。

血運重建在一定程度上解決了當下臨床問題，延長患牙的使用壽命，然而仍缺少大規(guī)模的臨床研究數(shù)據(jù)，并且組織學牙髓再生沒有真正實現(xiàn)，組織工程的引入為牙髓再生治療提供新的思路，目前研究較多的有3D打印、細胞膜片等技術，但干細胞的來源、儲存問題，適宜支架材料的選擇，生物工程微環(huán)境的構建等一系列問題給我們帶來了很大的挑戰(zhàn)，因此需要多學科共同協(xié)同發(fā)展，以期創(chuàng)建干細胞牙髓樣分化的微環(huán)境，實現(xiàn)牙功能性牙髓的再生，為患者帶來真正的福音。

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