三氧化二砷治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

張志峰

慶陽市人民醫(yī)院，甘肅 慶陽 745000

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種由多種自身抗體引起的多器官、多系統(tǒng)損害的自身免疫性結(jié)締組織疾病，以急性發(fā)作和緩解交替為特點(diǎn)，病情大多呈進(jìn)行性加重，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍不能根治。系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療以糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物和免疫抑制劑為基礎(chǔ)，雖然糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺(CTX)對(duì)SLE有一定的療效，但對(duì)重癥SLE給予小劑量療效不理想，大劑量則有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)，故迫切需要尋找一種有效低毒的治療藥物。近年來國(guó)內(nèi)外陸續(xù)有研究表明，三氧化二砷(As2O3)治療SLE具有很好的前景。法國(guó)學(xué)者Bobé等［1］發(fā)現(xiàn)As2O3對(duì)狼瘡鼠不僅具有免疫抑制作用，還有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，這是治療SLE常規(guī)的免疫抑制劑所不具備的。國(guó)內(nèi)也有將其應(yīng)用于治療SLE的研究［2-3］。筆者現(xiàn)將近10年來As2O3調(diào)節(jié)SLE發(fā)病機(jī)制、治療SLE及其毒性等實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展綜述如下：

1 治療機(jī)制

1.1 調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞 外來抗原(如病原體、藥物等)引起人體B細(xì)胞活化。易感者因免疫耐受性減弱，B細(xì)胞通過交叉反應(yīng)與模擬外來抗原的自身抗原相結(jié)合，并將抗原呈遞給T細(xì)胞，使之活化，在T細(xì)胞活化刺激下，B細(xì)胞得以產(chǎn)生大量不同類型的自身抗體，造成大量組織損傷。

1.1.1 調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫細(xì)胞 適應(yīng)性免疫應(yīng)答是指體內(nèi)B、T細(xì)胞接受“非己”的物質(zhì)刺激后，自身活化、增殖、分化為效應(yīng)細(xì)胞，產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的全過程。適應(yīng)性免疫細(xì)胞包括B細(xì)胞和T細(xì)胞。抑制B細(xì)胞：B細(xì)胞過度增殖、活化產(chǎn)生大量多種自身抗體從而造成多系統(tǒng)損害是SLE的顯著特征。王曉冰等［4-5］研究表明，As2O3能抑制MRL/lpr狼瘡鼠B淋巴細(xì)胞活化，但對(duì)正常小鼠的細(xì)胞亞群并無明顯影響。抑制T細(xì)胞：SLE患者的B細(xì)胞功能高度活化，但B細(xì)胞的活化是以T細(xì)胞異常為基礎(chǔ)且在其誘導(dǎo)下產(chǎn)生的，因此，SLE更是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，T細(xì)胞在SLE的免疫失調(diào)中起著主要作用［6］。夏曉茹等［7-8］、王曉冰等［9-10］研究表明，As2O3能抑制 MRL/lpr 小鼠 CD4＋T細(xì)胞的異常增殖活化。陳培榮等［11］研究表明，As2O3能在一定程度上有效抑制活化狀態(tài)下MRL/lpr小鼠脾臟CD4＋T細(xì)胞。

1.1.2 調(diào)節(jié)固有免疫細(xì)胞 固有免疫是生物在長(zhǎng)期進(jìn)化中逐漸形成的，是機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線。固有免疫細(xì)胞主要包括單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DC)、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)等。固有免疫細(xì)胞通過模式識(shí)別受體［甘露糖受體(MR)、清道夫受體(SR)和Toll樣受體(TLR)］或有限多樣性抗原識(shí)別受體對(duì)病原體及其感染細(xì)胞或衰老損傷和畸變細(xì)胞表面某些共有特定表位分子的識(shí)別結(jié)合，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和效應(yīng)等過程。抑制DC：DC是目前所知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞，可有效地刺激B細(xì)胞和T細(xì)胞的活化，從而將固有免疫和適應(yīng)性免疫有機(jī)聯(lián)系起來。大量研究表明，在SLE患者體內(nèi)無論是B細(xì)胞異常引起的體液免疫反應(yīng)還是T細(xì)胞異常引起的細(xì)胞免疫反應(yīng)，都與DC的功能改變有直接關(guān)系。楊柳等［12］，王曉冰等［4］研究表明，As2O3能上調(diào)NK細(xì)胞功能。抑制TLR：TLR連接了固有免疫和適應(yīng)性免疫，尤其是TLR7及TLR9，能夠同某些內(nèi)源性配體相結(jié)合，產(chǎn)生抗ssRNA抗體及抗DNA抗體，促進(jìn)干擾素-α(IFN-α)的分泌，在SLE發(fā)生和進(jìn)展中起重要作用。即表達(dá)上調(diào)的TLR7、TLR9及IFN-α有助于SLE 發(fā)?。?3-16］。

1.2 調(diào)節(jié)細(xì)胞因子 細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞及組織細(xì)胞分泌的在細(xì)胞間發(fā)揮相互調(diào)控作用的一類小分子可溶性多肽蛋白，通過結(jié)合相應(yīng)受體調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)分化和效應(yīng)，調(diào)控免疫應(yīng)答。其包括白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(IFN)、生長(zhǎng)因子(GF)等。

1.2.1 IL IL-4是Th2型細(xì)胞因子，是一種具有多種生物功能的細(xì)胞因子。IL作用于T細(xì)胞可促使靜止T細(xì)胞向Th2分化，介導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)；作用于B細(xì)胞可促其生長(zhǎng)、增殖及抗體的產(chǎn)生；還可刺激肥大細(xì)胞的活性，抑制單核巨噬細(xì)胞的功能，降低細(xì)胞毒活性和抑制Th1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。SLE患者血清IL-4水平明顯增高，且與SLE病情活動(dòng)性相關(guān)。林素仙［17］、王曉冰［9］及夏曉茹［7］等研究表明，As2O3能抑制 BXSB或MRL/lpr狼瘡鼠IL-4的水平。IL-6：屬于Th2細(xì)胞因子，是機(jī)體免疫網(wǎng)絡(luò)中重要的細(xì)胞因子，可由外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生，具有廣泛的生物學(xué)活性，能刺激T、B細(xì)胞增殖分化及免疫球蛋白分泌，參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)［18］。研究表明，SLE患者體內(nèi)IL-6顯著高表達(dá)，IL-6升高也可能與SLE關(guān)節(jié)的損害有關(guān)［19-20］。林雪萍等［21］研究表明，As2O3能抑制活動(dòng)期SLE患者T淋巴細(xì)胞IL-6的分泌。IL-10：是Th2型細(xì)胞因子，主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，作用于B細(xì)胞，刺激B細(xì)胞活化和分泌免疫球蛋白。IL-10水平升高與SLE疾病的活動(dòng)度增高有關(guān)［22-23］。龐貴秀［24］、夏曉茹［10］等研究表明，As2O3能抑制淋巴細(xì)胞分泌IL-10的能力。IL-12：是單核巨噬細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫調(diào)節(jié)中IFN-γ的產(chǎn)生［25］。研究發(fā)現(xiàn)，血漿中IL-12的表達(dá)水平與患者的SLE活性指數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)，其通過在炎性組織中招募效應(yīng)白細(xì)胞從而對(duì)炎癥部位的免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)節(jié)［26］。王曉冰等［5-9］研究表明，As2O3能降低血清IL-12水平和Th細(xì)胞內(nèi)IL-12的水平。

1.2.2 IFN IFN包括為Ⅰ型和Ⅱ型干擾素，Ⅰ型干擾素主要有IFN-α、IFN-β。Ⅱ型干擾素即IFN-γ。IFN-γ屬Th1型細(xì)胞因子，主要由淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，又稱免疫干擾素。其主要作用是通過激活單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)淋巴因子的生成，誘導(dǎo)細(xì)胞表面受體表達(dá)等。IFN-γ水平升高與腎損害的程度呈正相關(guān)［27］。王曉冰［5，9］、林素仙［17］、夏曉茹［7-8］、朱曉芳［28］等研究表明，As2O3能降低狼瘡鼠血清IFN-γ水平。陳培榮等［11］研究表明，1 mmol/L As2O3作用24小時(shí)能在一定程度上有效抑制活化狀態(tài)下MRL/lpr小鼠脾臟CD4＋T細(xì)胞IFN-γ的異常分泌。朱曉芳等［29］研究表明，As2O3降低狼瘡鼠血清 IFN-γ 水平的機(jī)制為可能通過影響MRL/lpr狼瘡鼠T-bet/GATA3信號(hào)通路，降低T-bet表達(dá)，從而減少Th1型細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)和分泌。

1.2.3 GF GF包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β(TGF-β)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VFGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)等。TGF-β是一種類多能細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)分泌及調(diào)節(jié)炎癥、免疫等功能，是目前認(rèn)為誘發(fā)纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原、纖維連接蛋白和糖蛋白的最強(qiáng)因子之一。在腎臟炎癥早期，TGF-β能募集血液循環(huán)中炎性細(xì)胞及成纖維細(xì)胞至腎小球和腎小管，促使炎癥進(jìn)一步發(fā)展，是損傷的腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生的最重要的細(xì)胞因子，在腎小管間質(zhì)纖維化中起重要介導(dǎo)作用。此外，還發(fā)現(xiàn)TGF-β在狼瘡腎炎中表達(dá)也顯著上調(diào)，與腎小管間質(zhì)纖維化之間相關(guān)聯(lián)，且腎小管間質(zhì)的病變與腎功能受累程度呈正相關(guān)［30］。陳丹等［31］研究表明，As2O3可下調(diào)狼瘡鼠腎小管TGF-β1的表達(dá)。

1.3 影響轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子是一類能與特異性DNA序列結(jié)合并調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的基因調(diào)控蛋白，主要有核因子κB(NF-κB)和激活子蛋白1(AP-1)等。NF-κB是普遍存在于細(xì)胞漿中以p50/p65異二聚體為形式的一種快反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子。主要生物功能是通過調(diào)節(jié)一系列重要的免疫因子參與免疫和炎癥反應(yīng)［32］。有研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB65可通過介導(dǎo)單核細(xì)胞趨化因子合成參與腎組織中單核細(xì)胞的募集反應(yīng)，從而加重腎小管間質(zhì)病變［33］。陳丹等［31］研究表明，As2O3可下調(diào)狼瘡鼠腎小管NF-κBp65的表達(dá)。

1.4 調(diào)控表觀遺傳學(xué) 表觀遺傳學(xué)是指不涉及基因突變或DNA堿基改變的、可以通過有絲分裂和減數(shù)分裂進(jìn)行遺傳的穩(wěn)定基因表達(dá)的變化，它是不符合傳統(tǒng)孟德爾遺傳規(guī)律的核內(nèi)遺傳。3種主要的表觀遺傳調(diào)控方式為：DNA甲基化、組蛋白修飾和微小RNA［34］。目前研究較多的還是前二者。

1.4.1 DNA甲基化 DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用下，利用S苷甲硫氨酸提供的甲基(團(tuán))，將甲基(團(tuán))轉(zhuǎn)移到DNA分子的脫氧胞苷的嘧啶環(huán)第5號(hào)碳原子上，使其轉(zhuǎn)變成甲基化脫氧胞苷。研究表明，SLE患者普遍有基因組DNA甲基化水平降低，血漿DNA低甲基化在SLE發(fā)病中可能起重要作用［35］。周艷［36］、王紅［2，37］、孫莉等［38］研究表明，As2O3能逆轉(zhuǎn)低甲基化狀態(tài)。朱載華等［39］進(jìn)一步研究表明，1 μmol/L As2O3作用 24 小時(shí)能在一定程度上有效逆轉(zhuǎn)活化狀態(tài)下MRL/lpr小鼠脾臟CD4＋T細(xì)胞IFN-γ基因啟動(dòng)子低甲基化。

1.4.2 組蛋白修飾 組蛋白復(fù)合體具有靈活的N端尾部，其延伸至核小體以外，會(huì)受到不同的化學(xué)修飾。被組蛋白覆蓋的基因如果要表達(dá)，首先要改變組蛋白的修飾狀態(tài)，使其與DNA的結(jié)合由緊變松，這樣靶基因才能與轉(zhuǎn)錄復(fù)合物相互作用。組蛋白的修飾形式包括乙?；⒓谆?、泛素化以及磷酸化等。其中組蛋白乙?；揎検亲钤绫话l(fā)現(xiàn)的與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的組蛋白修飾方式，組蛋白乙?；梢杂绊懠?xì)胞內(nèi)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而參與特定點(diǎn)位的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SLE患者CD4+T細(xì)胞中H3和H4的乙?；较陆?，且H3低乙酰化程度與SLE疾病活動(dòng)性呈負(fù)相關(guān)［40］。嘉婷等［3］研究表明As2O3能提高組蛋白H3的乙酰化水平，而對(duì)正常小鼠并無明顯影響。

1.5 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡。SLE患者存在凋亡增加和凋亡小體清除障礙等。林雪萍等［21，41］及龐貴秀等［24］研究表明，As2O3能誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞凋亡，并且具有時(shí)間和濃度依賴性。劉睿嬋等［42］進(jìn)一步研究表明，As2O3誘導(dǎo)MRL-lpr狼瘡腎炎小鼠自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用機(jī)制可能與激活caspase家族成員、抑制bcl-2等自身基因表達(dá)有關(guān)。

2 治療作用

朱小春［43］、夏曉茹［44］、王曉冰［9］、林素仙［17］、王紅［45］等研究表明，As2O3能明顯降低狼瘡鼠血清中抗 dsDNA 水平。朱小春［43］、陳丹［31］、王曉冰［5］等研究表明，As2O3能降低狼瘡鼠尿蛋白，血尿素氮，血肌酐，腎小球細(xì)胞計(jì)數(shù)和腎組織活動(dòng)積分，并有效抑制狼瘡鼠腎小球中IgG的沉著。林素仙［17］、夏曉茹［44］等、王紅［45］研究表明，As2O3能延長(zhǎng)狼瘡鼠的生存時(shí)間，降低死亡率。

3 減毒研究

已經(jīng)證明，As2O3通過誘發(fā)活性氧自由基，促發(fā)脂質(zhì)過氧化，主要是H2O2和O2-，引起細(xì)胞DNA損傷，同時(shí)刺激釋放與損傷有關(guān)的各種促炎癥因子在組織表達(dá)，并可通過激發(fā)caspase途徑引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致組織損傷［46-48］。劉中祿等［49］研究表明，白藜蘆醇(RES)具有良好的抗As2O3所致的氧化損傷和抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除氧自由基，減少體內(nèi)NO自由基生成，減輕NO毒性，且呈劑量依賴性。張靖宇等［50］研究表明，大劑量白藜蘆醇可減輕As2O3引起的實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)損傷，其機(jī)制亦與其提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性及拮抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。同時(shí)Walle、shen等［51-52］在研究RES對(duì)As2O3抗腫瘤作用的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)RES沒有減弱As2O3對(duì)A549細(xì)胞的抗腫瘤作用，相反白藜蘆醇可減弱A549細(xì)胞的生長(zhǎng)，結(jié)果顯示二者具有聯(lián)合作用。為二者聯(lián)合應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

4 安全研究

王紅等［53］研究表明，As2O3能明顯增加MRL/lpr自發(fā)性狼瘡小鼠的體質(zhì)量，明顯減低其累積病死率，而對(duì)C57正常小鼠則無明顯作用。

5 不良反應(yīng)

吳楠等［54］用治療劑量 As2O3(每日 10 mg，稀釋后靜脈滴注)治療急性早幼粒細(xì)胞白血病時(shí)發(fā)現(xiàn)其不良反應(yīng)主要有：1)神經(jīng)系統(tǒng)：輕度頭痛及頭暈、乏力、失眠，無煩躁、嗜睡、譫妄、昏迷驚厥等；2)皮膚：丘疹、紅斑及蕁麻疹樣皮疹，皮膚干燥，砷斑；3)消化系統(tǒng)：食欲減退、腹脹、輕度腹瀉、惡心，無腹痛、劇烈嘔吐及嚴(yán)重腹瀉等；4)肝功能：天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)增高；5)周圍神經(jīng)：手足麻木、肌肉酸痛，無感覺減退和肌無力；6)黏膜刺激：鼻干、咽干，無口腔潰瘍和瞼結(jié)膜充血；7)心血管系統(tǒng)：心悸及ST及T波變化；8)水鈉潴留：體質(zhì)量增加，無胸腔、腹腔及心包積液；9)其他：無指甲的Mees線和相關(guān)癌腫。并將其不良反應(yīng)劃分為砷吸收，輕度不良反應(yīng)，慢性輕度與慢性中度中毒。治療劑量注射液的不良反應(yīng)多為輕度、可逆的。

6 毒性方面

一般認(rèn)為，超標(biāo)的As2O3有致癌、致畸、致突變等作用，治療量的As2O3有治療作用。研究表明［55］，As2O3誘導(dǎo)RA滑膜B型細(xì)胞影響時(shí)發(fā)現(xiàn)其有潛在的致癌作用。但還沒有人體應(yīng)用砷劑致癌的病例報(bào)道。

7 展望

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為砷是人體中必需的超微量元素之一，有其難以替代的作用，但砷制劑畢竟是劇毒類藥物。As2O3在低劑量時(shí)具有誘導(dǎo)分化作用，在高劑量時(shí)則對(duì)細(xì)胞具有原漿毒作用，其時(shí)間累積與劑量大小都至關(guān)重要。因此，As2O3作為一個(gè)新的誘導(dǎo)分化劑，在治療SLE過程中，如何在保證療效的前提下，減少其毒副作用是值得首先考慮的問題。在它的劑量大小、細(xì)胞周期特異性、用藥方式的選擇及體內(nèi)蓄積產(chǎn)生的毒副作用等很多方面，還有待于我們進(jìn)一步探索和研究。