清肝祛濕活血方對(duì)非酒精性脂肪肝大鼠腫瘤壞死因子α及肝臟組織的影響*

張玉香 ，王一強(qiáng) ，姜德民 ，王鳳麗 ，史曉偉 ，陳有源 ，王俊喹 甘肅省中醫(yī)學(xué)校，甘肅 蘭州 70050；甘肅省中醫(yī)院；蘭州市安寧區(qū)醫(yī)院；西和縣中醫(yī)院

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFLD)是肝細(xì)胞性肝硬化的重要病因［1-2］。近年來，發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)［3-4］。而中醫(yī)藥在治療NAFLD方面起到越來越重要的作用，主要作用機(jī)制為調(diào)節(jié)脂肪組織分泌和儲(chǔ)存、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激等［5］，具有多靶點(diǎn)治療、安全可靠的特點(diǎn)。清肝利濕活血方為王俊喹經(jīng)驗(yàn)方，用于治療肝經(jīng)濕熱瘀阻型NAFLD。前期臨床研究［6］表明，其具有改善NAFLD患者臨床癥狀，降低體質(zhì)指數(shù)、腰圍，改善肝功能和胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血脂代謝的作用。本研究采用高脂飲食建立NAFLD大鼠模型，觀察清肝祛濕活血方對(duì)NAFLD大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)及肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取同批清潔級(jí)SD大鼠，雄性，90只，體質(zhì)量130～170 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK(甘)2011-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 清肝祛濕活血方藥物組成：茵陳10g，郁金 10g，青葙子 10g，丹參 15g，夏枯草 10g，密蒙花10 g，垂盆草10 g。由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備中藥煎劑。羅格列酮片(太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20041399，規(guī)格4 mg/粒)。腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 GS300型血糖儀(華廣生技股份有限公司)；OHAUS1/1000型電子天平(美國BECKANCOULTER公司)；IX71-22FL/PH型倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)(瑞典LKB公司)；TC-120型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(孝感泰維電子設(shè)備有限公司)；HH-S型數(shù)顯水浴箱(金壇醫(yī)療儀器廠)；5417R型低溫離心機(jī)(德國艾本德公司)；TC-120型生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北泰維電子設(shè)備有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物分組與造模 將90只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，羅格列酮組，清肝祛濕活血方高、中、低劑量組，每組15只。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7天，常規(guī)飲食，自由飲水。從第8天開始正常組給予普通飼料，連續(xù)60天；其余各組按照聶文山等［7］的造模方法，予高脂飼料(84%基礎(chǔ)飼料+10%豬油+5%蛋黃粉+1%膽固醇)喂養(yǎng)1周后腹腔注射四環(huán)素(150 μg/g，然后每隔6天腹腔注射1次四環(huán)素)100 μg/g；分別于實(shí)驗(yàn)開始前及造模后第 6、12、18、24、30 天稱量大鼠的體質(zhì)量，依據(jù)造模大鼠體質(zhì)量的變化改變給藥量，造模時(shí)間30天。

1.4.2 給藥方法 參考《藥物試驗(yàn)方法學(xué)》［8］，按照人與大鼠的體質(zhì)量換算，大鼠的等效劑量為：生藥11.25 g/kg。中藥復(fù)方高、中、低劑量組依次為生藥22.50、11.25、5.63 g/kg。將清肝祛濕活血方用蒸餾水配制成濃度為0.28、0.56、1.13 g/mL的溶液。根據(jù)文獻(xiàn)［9］報(bào)道，羅格列酮組用藥劑量為3mg/(kg·d)造模成功后大鼠平均體質(zhì)量按200g/只計(jì)算，干預(yù)組各大鼠每日灌胃給藥1次，每次4 mL。正常對(duì)照組與模型對(duì)照組分別給予蒸餾水灌胃，1/d次，4 mL/次。各組大鼠連續(xù)灌胃30天，末次灌胃24小時(shí)后處死并測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.4.3 觀察指標(biāo)

1.4.3.1 TNF-α測(cè)定 實(shí)驗(yàn)前大鼠空腹至少8小時(shí)，經(jīng)鼠尾采血5 mL，室溫放置2小時(shí)后，離心15分鐘，3 000 r/min，取上清液，放冰箱-20℃保存。TNF-α采用酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測(cè)。

1.4.3.2 肝臟組織病理形態(tài)觀察 處死大鼠，迅速摘取肝組織，并將肝臟浸泡于10%甲醛內(nèi)固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行常規(guī)HE染色。肝組織脂變程度判斷標(biāo)準(zhǔn)。見表1。

表1 肝組織脂變程度判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均經(jīng)SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料用(±s)表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清TNF-α 羅格列酮致大鼠死亡1只，中藥復(fù)方低、中、高劑量組分別死亡2只，2只及4只。血清TNF-α水平，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與模型對(duì)照組比較，清肝祛濕活血方各劑量組及羅格列酮組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清TNF-α水平比較(±s)

表2 各組大鼠血清TNF-α水平比較(±s)

注：*表示與空白對(duì)照組比較，P＜0.05；#表示與模型對(duì)照組比較，P＜0.05

組別 只數(shù) 劑量/(g·kg-1) TNF-α/(mol·L-1)空白對(duì)照組 15 - 0.88±0.14模型對(duì)照組 15 - 2.68±0.20*羅格列酮組 14 0.55 1.69±0.11#低劑量組 13 5.63 2.08±0.16#中劑量組 13 11.25 1.72±0.18#高劑量組 11 22.5 1.35±0.14#

2.2 肝臟組織病理形態(tài) 空白對(duì)照組大鼠肝臟外形大小正常，呈紅色，肝小葉內(nèi)未見脂滴肝細(xì)胞，為陰性。模型對(duì)照組大鼠腹腔肥大，肝體積增大明顯，脂肪組織豐富，表面粗糙呈灰黃色，肝血竇擴(kuò)張，充血，切面油膩感，胞質(zhì)內(nèi)幾乎均呈脂滴肝細(xì)胞，為(++++)。與模型對(duì)照相比較，羅格列酮組，中藥復(fù)方低、中劑量組大鼠肝臟脂肪組織含量減少，肝臟體積偏大，呈暗紅色。脂變程度較輕，空泡樣變肝細(xì)胞數(shù)目明顯減少，胞漿內(nèi)僅見少量脂肪滴，為(++)。中藥復(fù)方高劑量組肝臟脂變程度明顯減輕，肝小葉基本完整，空泡樣變肝細(xì)胞消失，為(+)。見圖1。

圖1 肝組織病理切片(HE×400)

3 討論

NAFLD的發(fā)病與胰島素抵抗和遺傳易感性關(guān)系密切。根據(jù)臨床不同時(shí)期的臨床表現(xiàn)可將其歸屬于中醫(yī)學(xué)中“脂滿”“肝著”“積聚”“痰證”等范疇。本課題組認(rèn)為NAFLD的病機(jī)為肝火旺盛、濕熱瘀結(jié)。清肝祛濕活血方以夏枯草清肝散郁；密蒙花清熱瀉火，養(yǎng)肝明目；青葙子清肝涼血；茵陳清熱利濕、退黃；垂盆草清熱解毒、利膽；丹參、郁金散結(jié)化瘀，行氣通絡(luò)。諸藥合用活血化瘀，清肝祛濕［10-11］。

近來有關(guān)炎癥因子TNF-α在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的作用備受關(guān)注［12］。TNF-α是機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子，其可通過增加氧自由基和脂質(zhì)過氧化而導(dǎo)致脂肪性肝纖維化。黃永紅［13］研究指出，NAFLD發(fā)展到一定階段時(shí)，脂肪組織中的TNF-α水平與胰島素抵抗呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是非糖基化細(xì)胞因子，是炎癥和代謝失衡的重要脂肪因子，可引起線粒體功能不全、肝細(xì)胞變性壞死及炎細(xì)胞浸潤，加重脂肪肝的程度［14-15］。本研究結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)，清肝祛濕活血方高劑量干預(yù)組可顯著降低NAFLD大鼠TNF-α水平，說明清肝祛濕活血方可通過增強(qiáng)機(jī)體對(duì)TNF-α的清除能力來改善NAFLD。這與相關(guān)文獻(xiàn)［16］報(bào)道一致。

綜上所述，清肝祛濕活血方防治非酒精性脂肪肝可能的機(jī)制是下調(diào)肝臟TNF-α水平。