抗氧化劑對家畜精液冷凍保存效果的影響研究進展

張利坤，井辛宇，白 騰,李 宇，任 發(fā)，溫 飛，康懷艷，李 梅，胡建宏，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.白水縣畜牧技術(shù)推廣站;3.子州縣畜牧技術(shù)推廣站； 4.白水縣家畜改良站)

近年來，隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，家畜養(yǎng)殖數(shù)量在不斷的增加，養(yǎng)殖規(guī)模在不斷的擴大，人工授精技術(shù)也在家畜生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用。人工授精技術(shù)在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用，不僅有效降低了病原菌在家畜交配過程中的傳播，而且提高了良種公畜的利用率，從而大大減少養(yǎng)殖資金投入，增加養(yǎng)殖收入。家畜人工授精技術(shù)的應(yīng)用離不開精液的體外保存，高質(zhì)量的體外保存精液是提高種公畜利用率和母畜受胎率的必然保障。精液冷凍保存便于精液長期體外儲存和長途運輸，遺傳資源可以跨時間和跨地域得到應(yīng)用，從而擴大了優(yōu)良畜種遺傳資源的應(yīng)用與推廣，加快了優(yōu)良畜種的改良進度。雖然精液冷凍保存具有很大的應(yīng)用前景，但是在精液冷凍保存的過程中，精子細胞內(nèi)外環(huán)境會發(fā)生極大的變化，精子細胞會受到不同因素的損傷，包括冷休克、冰晶損傷、氧化應(yīng)激等，造成解凍后精液品質(zhì)下降，嚴重影響并制約精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展。在精液冷凍的過程中，精子細胞會產(chǎn)生過量的活性氧，對精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性造成氧化應(yīng)激損傷。大量研究表明，在精液冷凍保存中，外源抗氧化劑能有效減少精子細胞所產(chǎn)生的過量活性氧，降低精子的氧化損傷程度，提高凍融后精液品質(zhì)。目前，精子的冷凍損傷機制和抗氧化劑的篩選，仍需要進一步探究。因此，本文主要對常用抗氧化劑的特性及其保護精子免受氧化性損傷機理進行綜述，以期為家畜精液的冷凍保存提供一定的理論依據(jù)，為進一步發(fā)揮良種優(yōu)勢提供科學(xué)資料與參考。

1 精子冷凍保存氧化性損傷機制

在精液冷凍保存的過程中，精子細胞內(nèi)外環(huán)境發(fā)生極大的變化，精子細胞會產(chǎn)生過量的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，ROS 攜帶著氧化性極強的自由基，極易與精子質(zhì)膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)或?qū)蛹毎麅?nèi)組織造成損傷，使精子失去正常的生理功能。在正常生理條件下，精子細胞自身含有抗氧化體系，精子細胞內(nèi)含有一定濃度的ROS，低濃度的 ROS可以維持細胞結(jié)構(gòu)和功能的完整性。在冷凍條件下，精子內(nèi)用于消除ROS的抗氧化酶活性會大大降低，ROS的產(chǎn)生速率超過機體內(nèi)抗氧化體系清除ROS的速率，使得精子細胞內(nèi)ROS含量過高，造成精子氧化損傷，最終導(dǎo)致精子活率和活力降低。

2 抗氧化劑對冷凍精子的作用

抗氧化劑是一類能夠有效抑制氧化反應(yīng)的物質(zhì)，易與活性氧攜帶的氧自由基結(jié)合，阻止 ROS和精子細胞質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸形成共價鏈接反應(yīng)，保護精子免受氧化應(yīng)激損傷，進而提高精子的冷凍保存質(zhì)量。因此，外源抗氧化劑添加到精液冷凍稀釋液中，能夠降低精子冷凍過程中所產(chǎn)生的過量活性氧，降低ROS對精子的氧化應(yīng)激損傷程度，提高冷凍精液品質(zhì)?？寡趸瘎┑姆N類很多，常見的抗氧化劑可分為酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑。

2.1 酶類抗氧化劑

超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)。SOD和CAT是精漿和線粒體內(nèi)存在的最基本的抗氧化劑，SOD能將O2-轉(zhuǎn)變?yōu)槿醵拘?H2O2，CAT能夠迅速將H2O2降解為H2O，從而起到保護精子免受氧化應(yīng)激損傷的作用。

劉超等研究結(jié)果表明，山羊精漿中添加SOD能有效提高精子的活力。Li研究表明，在精液冷凍稀釋液中，添加 CAT 能夠有效提高凍融后精液品質(zhì)。王貞研究發(fā)現(xiàn)，單獨添加SOD或CAT都能改善凍融后豬精液品質(zhì)，但是SOD和CAT組合添加效果更好。

2.2 非酶類抗氧化劑

2.2.1 維生素類抗氧化劑

維生素C(Vitamin C，VC)又稱抗壞血酸，屬于水溶性維生素，具有清除ROS而發(fā)揮其抗氧化作用，有效提高凍融后精液質(zhì)量。權(quán)富生等研究表明，在無角道塞特綿羊冷凍精液稀釋液中，添加濃度為4.4 mg/mL VC有效提高了精液品質(zhì)。黃俻華研究發(fā)現(xiàn)，600 μg/mL VC可以顯著提高陸川豬解凍后精子活力(P< 0.05)，畸形率顯著降低(P< 0.05)。HU研究結(jié)果表明，4.5 mg/mL VC能顯著改善凍融后精液品質(zhì)，并且能提高精漿中抗氧化酶的活性，有效保護精子質(zhì)量。

維生素E(Vitamin E，VE)又稱α-生育酚，屬于多酚類脂溶性維生素，是一種非常有效的預(yù)防誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抗氧化劑。VE易與細胞膜上的磷脂結(jié)構(gòu)相結(jié)合，阻止ROS和膜脂質(zhì)中的脂肪酸發(fā)生共價鏈接反應(yīng)，有效減輕精子細胞受到的氧化應(yīng)激損傷程度，保護精子的正常性能。趙憲林等研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍精液稀釋液中，濃度為0.4～0.8 mg/mL的 VE可以提高秦川牛精液中抗氧化酶的活性，對精液品質(zhì)具有保護作用?？得详栄芯勘砻鳎P(guān)中驢冷凍精液稀釋液中添加 600 mg/LVE有效提高了解凍后精子完整率和活率。吳大平研究發(fā)現(xiàn)，水牛冷凍稀釋液中添加0.4 mg/mL的VE能夠較好的保護凍融后精子質(zhì)膜的完整性，同時顯著提高了GSH-Px酶的活性(P< 0.05)，顯著降低了精子畸形率(P< 0.05)。大量研究表明，VE與其他抗氧化劑組合添加到精液冷凍液稀釋液中，具有更強的抗氧化效應(yīng)。Zhao等研究發(fā)現(xiàn)，在秦川牛精液冷凍稀釋液中，添加0.12 IU/mL VE與和400 IU/mL Vc能有效提高精液中CAT及GSH-Px的活性，起到保護精液品質(zhì)的作用。

由此說明，在家畜精液冷凍保存過程中，維生素能有效提高凍融后精液品質(zhì)。目前，VC和VE是較為常用的抗氧化劑。VC和VE與其他抗氧化劑的組合效果及其最佳配伍濃度，仍需要進一步探求。

2.2.2 氨基酸類抗氧化劑

(1)半胱氨酸

半胱氨酸是一種天然氨基酸，屬于含硫非必需氨基酸。半胱氨酸極易被氧化還原成胱氨酸，它具有一定的抗氧化性。因此，半胱氨酸在精液冷凍保存過程中，可以保護精子質(zhì)膜免受氧化損傷。有關(guān)研究表明，在牛精液冷凍過程中，2 mmol/L半胱氨酸可以有效保護線粒體和頂體的完整性。范楚寧研究發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L或7.5 mmol/L的半胱氨酸對獺兔的精液保存效果最佳。Khalili研究表明，15 mmol/L 的半胱氨酸能顯著提高羊冷凍精液的質(zhì)量(P< 0.05)。

從以上結(jié)論可以看出，不同種類動物的冷凍保存精液稀釋液中所添加的半胱氨酸濃度差異較大，其原因需要進一步的探究。

(2)麥角硫因

麥角硫因是自然界存在較少的天然氨基酸，動物體內(nèi)麥角硫因是一種很重要的低分子量硫醇，能夠清除單線態(tài)氧、羥基和過氧自由基，具有很強的抗氧化性。麥角硫因可以激活抗氧化酶的活性，如谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性。機體組織代謝中含有微量的麥角硫因，可以螯合二價金屬離子，麥角硫因與鐵、銅、鋅的代謝密切相關(guān)。

Coyan等研究發(fā)現(xiàn)，在美利奴公羊冷凍精液補充液中，麥角硫因可以保護精子細胞免受氧化應(yīng)激損傷。麥角硫因具有天然無毒的性能和較強的抗氧化性，其將成為取代其他抗氧化劑的最適選擇。

2.2.3 多糖類抗氧化劑

海帶多糖為海帶提取物，具有良好的藥理功效，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)細胞因子、降血壓、抗氧化等。紅景天是一種多年生草本植物。紅景天多糖是紅景天植物的提取物，能夠清除活性氧自由，具有良好的抗氧化性能。另外，多糖具有一定的粘性，可以粘附在精子周圍，提高精子細胞周圍的滲透壓，使得胞內(nèi)失水，減少細胞內(nèi)冰晶形成，起到保護精子的作用。張婷研究發(fā)現(xiàn)，精液稀釋液中添加濃度為0.5～1.5 mg/mL的海帶多糖對豬精子的結(jié)構(gòu)和功能有顯著保護作用，有效提高了凍融后精液品質(zhì)?？得详栐陉P(guān)中驢冷凍精液稀釋液中，1 500 mg/L海帶多糖能有效保護精子的結(jié)構(gòu)和功能的完整性。HU等結(jié)果表明，海帶多糖能提高精子活率，同時能增強精漿中抗氧化酶的活性。陳西英研究結(jié)果表明，精液稀釋液中，海帶多糖濃度為1.0 mg/mL對保護精子的效果最好。曹華琳將濃度為0.06 mg/mL紅景天添加到牛精液冷凍稀釋液中，能提高解凍后精液中抗氧化酶的活性，降低氧化應(yīng)激損傷程度，保護精子質(zhì)膜的完整性。

多糖是由單糖通過糖苷鍵連接而成的化合物，屬于非滲透性保護劑。多糖具有抗氧化性，它不僅能降低活性氧的量，而且能提高過氧化酶的活性，最終降低細胞的氧化損傷程度。另外，在精液冷凍的過程中，多糖在精子外圍聚集，提高外圍滲透壓，引起細胞失水，減少冰晶損傷，達到保護精子的作用。目前，從眾多研究中發(fā)現(xiàn)，多糖類抗氧化劑對冷凍精子的保護作用，其組合效果要優(yōu)于單獨添加的效果。這需要進一步探討合適配伍的抗氧化劑及其添加的濃度，期望優(yōu)化冷凍稀釋液的配置，提高家畜精液冷凍保存效果。

2.2.4 其他抗氧化劑

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是細胞內(nèi)含有巰基的非蛋白化合物，屬于一種多肽，它通過巰基發(fā)揮抗氧化作用，同時具有維護外源性抗氧化劑的作用。GSH具有抗氧化和抵御細胞毒性的功能，GSH 可以通過多種方式保護家畜精子的氧化應(yīng)激損傷，一方面GSH與氧自由基結(jié)合而直接清除自由基；另一方面GSH可催化GSH-Px 活性，使精子細胞內(nèi)低毒性的H2O2轉(zhuǎn)化為H2O。另外GSH 能于磷脂結(jié)構(gòu)的細胞膜形成穩(wěn)定的化合物，保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷。

據(jù)報道，在公羊精液稀釋液中，添加2 mL的GSH能夠增強谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，減少了自由基形成和提高了精子活率。康孟陽研究發(fā)現(xiàn)，在關(guān)中驢冷凍精液中，1 000 mg/L的GSH可以提高解凍后精子結(jié)構(gòu)完整性和精子活率。段洪云等研究表明，GSH可以與細胞膜的脂肪酸形成穩(wěn)定的化合物，使精子細胞免受ROS的氧化損傷。Muhammad等研究結(jié)果說明，GSH能保護綿羊精液凍融后DNA的完整性及提高精液品質(zhì)。

由此可見，GSH具有較強的抗氧化性，對提高冷凍精液品質(zhì)有一定的作用，可以通過試驗研究推廣GSH的使用范圍。

褪黑素(Melatonin，MLT)是一種胺類激素，具有非常強的清除活性氧自由基的功能，通過抑制氧化反應(yīng)來保護細胞膜脂質(zhì)結(jié)構(gòu)、核酸、蛋白質(zhì)等。褪黑素不僅能夠清除活性氧自由基，而且可以清除自由基的產(chǎn)物，還能促進抗氧化酶的表達，以及降低促氧化酶的活性。楊寶衛(wèi)等研究結(jié)果表明，10 mmol/L的褪黑素能有效降低凍融豬精子的死精子率，有效提高豬凍精品質(zhì)。Amidi等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素可以提高多種動物冷凍精液的質(zhì)量，包括山羊、公豬和牛等。吳大平研究表明，在水牛精液冷凍稀釋液中，添加褪黑素可以降低精子的畸形率，提高凍融后精子活率和抗氧化物酶的活性，其最適添加濃度為0.2 mg/mL。李博玲等研究發(fā)現(xiàn)，添加0.25 mg/mL的褪黑素可有效提高凍融豬精液品質(zhì)。

3 展望

目前，我國雖然家畜人工授精技術(shù)的應(yīng)用與推廣已取得顯著成效，但是家畜精液冷凍保存技術(shù)仍有很大的發(fā)展空間。隨著家畜精液冷凍保存技術(shù)的深入研究，抗氧化劑改善精液品質(zhì)方面還需要進一步探究，如篩選天然植物提取抗氧化劑及不同抗氧化劑組合的實踐應(yīng)用效果，充分發(fā)揮抗氧劑對冷凍精子的保護作用，有助于加速精液冷凍保存技術(shù)的發(fā)展，提高優(yōu)良畜種的利用率，進一步推動我國養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展。