玻璃體液化機(jī)制的研究進(jìn)展

陳萍萍，楊路，陳曦

玻璃體是一種少細(xì)胞而富含水分的細(xì)胞外基質(zhì)（含水為98%）[1]，呈透明的凝膠狀態(tài)，主要由纖細(xì)的膠原結(jié)構(gòu)、親水的透明質(zhì)酸和很少的玻璃體細(xì)胞組成玻璃體凝膠。玻璃體呈凝膠狀態(tài)，約3.9 ml，占眼球80%的容積，除了在眼球發(fā)育中發(fā)揮重要的作用外，還能對(duì)視網(wǎng)膜和晶狀體起到減震、支持作用，并能阻止大分子物質(zhì)和細(xì)胞進(jìn)入玻璃體，而維持其透明。玻璃體液化與許多眼病的發(fā)生有重要關(guān)系，如裂孔性視網(wǎng)膜脫離、玻璃體出血、玻璃體相關(guān)性青光眼、高度近視、黃斑裂孔形成、睫狀體平坦部炎癥、視網(wǎng)膜色素變性及眼銅質(zhì)沉著癥等。玻璃體液化在這些眼病的發(fā)展機(jī)制中起著重要作用，因此對(duì)玻璃體液化機(jī)制進(jìn)行研究以尋求更好的預(yù)防和治療方法意義重大。

1 玻璃體的超微結(jié)構(gòu)

構(gòu)成玻璃體凝膠的膠原纖維呈三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，膠原纖維的密度因部位而異，中央?yún)^(qū)膠原纖維的密度最低，皮質(zhì)次之，基底部最密集。中央?yún)^(qū)膠原纖維網(wǎng)稀疏，膠原纖維彼此相互連接，較粗的纖維之間可觀察到比其直徑更加細(xì)小的纖維，后者通常位于膠原纖維或纖維束的交匯處。膠原纖維在皮質(zhì)部形成海綿網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在基底部規(guī)則、有序、密集排列，其粗寬的纖維束交織在一起，各束之間有細(xì)小的纖維連接。在玻璃體的基底部和皮質(zhì)部，玻璃體細(xì)胞與膠原纖維結(jié)合并分布于纖維網(wǎng)中[2]。

2 玻璃體的主要膠原成分

玻璃體內(nèi)主要膠原細(xì)纖維由多種類(lèi)型膠原組成，包括Ⅱ、Ⅴ/Ⅺ和Ⅸ型膠原。（1）Ⅱ型膠原：Ⅱ型膠原是玻璃體內(nèi)的主要膠原成分，占膠原總量的70%～80%。它由 3個(gè)相同的 -鏈（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）組成。Ⅱ型膠原分子以共價(jià)方式交叉結(jié)合在一起，包繞Ⅴ/Ⅺ型膠原形成主膠原細(xì)纖維束。衰老與人的玻璃體膠原纖維表面的顯著變化有關(guān)，包括IX型膠原蛋白和其半衰期為11年的硫酸軟骨側(cè)鏈的指數(shù)損失，以及II型膠原蛋白暴露增加了 4 倍的變化[3]。（2）Ⅴ/Ⅺ型膠原：其位于主膠原細(xì)纖維中心部，構(gòu)成主膠原細(xì)纖維的中心核；Ⅴ型和Ⅺ型膠原在結(jié)構(gòu)和功能上非常相似。（3）Ⅸ型膠原：其是玻璃體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的組成主膠原細(xì)纖維的第三類(lèi)膠原分子。這種膠原包含3種不同的鏈：1（Ⅸ），2（Ⅸ）及 3（Ⅸ），Ⅸ型膠原的結(jié)構(gòu)要比上述幾種膠原復(fù)雜的多。與Ⅱ型和Ⅴ/Ⅺ型膠原不同的是，這些膠原不在主膠原細(xì)纖維內(nèi)交叉連接，而通常分布并交叉連接細(xì)纖維表面。電鏡下Ⅸ型膠原以柱狀形式突出于細(xì)纖維表面。Ⅸ型膠原帶大量的正電荷，可以與其他基質(zhì)成分交叉結(jié)合。Ⅸ型膠原的第二個(gè)重要特征是它可以蛋白多糖的形式存在。人類(lèi)玻璃體凝膠用陽(yáng)離子染料染色后電鏡分析顯示，硫酸黏多糖規(guī)則地分布和延伸于主膠原細(xì)纖維表面。隨著年齡的增長(zhǎng)，可能是由于它的硫酸軟骨素側(cè)鏈的減少，使得保護(hù)II型膠原作用會(huì)被清除，從而導(dǎo)致“黏性”II型膠原蛋白的表面暴露，從而使玻璃體膠原纖維融合在一起。這些變化可能是玻璃體液化的基礎(chǔ)，也可能使玻璃體附著減弱[4]。(4)Ⅵ型膠原：其是玻璃體內(nèi)存在的另一種膠原細(xì)纖維，Ⅵ型膠原微纖維存在量少于主膠原細(xì)纖維，但它也是玻璃體內(nèi)的重要結(jié)構(gòu)成分，起著連接Ⅱ型膠原的作用，并能夠交叉連接透明質(zhì)酸。

3 玻璃體液化的影響因子

3.1 透明質(zhì)酸酶 透明質(zhì)酸酶可以特異地作用于透明質(zhì)酸，引起透明質(zhì)酸解聚和降解，透明質(zhì)酸分子從膠原細(xì)纖維間隙中釋放出來(lái)并重新分布，膠原細(xì)纖維聚合形成玻璃體纖維，從而產(chǎn)生玻璃體液化。有研究從正常人眼玻璃體內(nèi)分離出透明質(zhì)酸酶并證實(shí)具有相當(dāng)?shù)幕钚裕@說(shuō)明透明質(zhì)酸酶可能對(duì)玻璃體的膠樣結(jié)構(gòu)有重要影響。還有研究報(bào)道了外源性透明質(zhì)酸酶引起玻璃體液化的效力和安全性，發(fā)現(xiàn)兔眼內(nèi)注入10 U或以上的透明質(zhì)酸酶后，5周左右可引起玻璃體液化和玻璃體后脫離（PVD），并認(rèn)為可利用此酶作為輔助傳統(tǒng)機(jī)械性玻璃體切割手術(shù)的一種手段。

3.2 基質(zhì)金屬蛋白酶 正常人眼玻璃體中含有基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和MMP-9酶原[5]。有研究表明，激活態(tài)的MMP-2對(duì)Ⅱ型膠原無(wú)明顯作用，但可降解V/XI型膠原及IX型膠原片段COL2和 COL3，在體外實(shí)驗(yàn)中也可觀察到MMP-2降解玻璃體凝膠的現(xiàn)象；該研究認(rèn)為MMP-2的激活是年齡相關(guān)性玻璃體液化和各種玻璃體視網(wǎng)膜病理變化的可能機(jī)制[6]。隨著年齡增加，玻璃體內(nèi)MMP-2酶原和 MMP-9酶原含量無(wú)變化，但纖溶酶量增加，這種酶可降解纖維連接蛋白、Ⅵ型膠原及蛋白多糖的核心蛋白，并激活MMPs[7]，二者共同分解膠原，導(dǎo)致玻璃體液化，同時(shí)還可分解玻璃體與內(nèi)界膜的粘連[8]導(dǎo)致PVD。Bishop等[9]研究發(fā)現(xiàn)，老化玻璃體的膠原纖維束表面Ⅸ型膠原的丟失，導(dǎo)致內(nèi)層的Ⅱ型膠原大量暴露。他認(rèn)為，Ⅸ型膠原憑借連接的硫酸軟骨素側(cè)鏈遮蔽Ⅱ型膠原免于暴露，維持玻璃體正常結(jié)構(gòu)，而老化玻璃體的活性MMP-2增加，分解了Ⅸ型膠原，使Ⅱ型膠原暴露而相互黏著凝聚致玻璃體液化及PVD。

3.3 胰蛋白酶 另一種適合于Ⅱ型膠原蛋白降解的候選酶家族是胰蛋白酶。胰蛋白酶-1和胰蛋白酶-2存在于玻璃體中。胰蛋白酶家族由4種酶組成，即胰蛋白酶-1、胰蛋白酶-2、胰蛋白酶-3和胰蛋白酶-4，具有高序列同源性，源自3種不同的基因[10]。它們被分泌為不活躍的胰蛋白酶原，之后形成了活躍的胰蛋白酶。最初，胰蛋白酶在胰腺中發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶-1和胰蛋白酶-2具有消化食物的功能，而胰蛋白酶-3和胰蛋白酶-4被認(rèn)為在蛋白酶抑制劑降解中發(fā)揮了作用[11]。胰蛋白酶-1具有降解膠原蛋白的活性，胰蛋白酶-2是一種中性的絲氨酸蛋白酶，它直接降低了Ⅱ型膠原蛋白的三重螺旋[12]。Moilanen等[10]發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶-2可以直接或間接地通過(guò)基質(zhì)啟動(dòng)及直接刺激Ⅰ型膠原溶解酶原激活系統(tǒng)。

3.4 金屬離子 金屬離子氧化還原反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的自由基對(duì)生物系統(tǒng)具有氧毒性。Chattopadhyay等[13]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)玻璃體內(nèi)Cu2＋濃度高于0.145 mol/g時(shí)玻璃體出現(xiàn)液化，F(xiàn)e2＋在濃度為0.00145

mol/g時(shí)亦出現(xiàn)玻璃體液化，F(xiàn)e2＋比Cu2＋有更強(qiáng)的促使玻璃體液化的能力。維生素C與Cu2＋或Fe2＋有協(xié)同作用，在有外源性維生素C存在下，玻璃體液化明顯增加。金屬離子氧化產(chǎn)生的自由基可使透明質(zhì)酸降解和膠原細(xì)纖維碎裂。因此，Cu2＋可能引起透明質(zhì)酸和膠原二者的降解，從而導(dǎo)致玻璃體液化。臨床上觀察到眼銅質(zhì)沉著癥時(shí)的玻璃體液化就是 Cu2＋氧化產(chǎn)生自由基使透明質(zhì)酸和玻璃體膠原二者均降解所造成的。因此,有理由假設(shè)，對(duì)抗氧化過(guò)程的防御機(jī)制的降低可能導(dǎo)致老年或病理性玻璃體液化[13]。

3.5 核黃素 正常人玻璃體中含有少量的核黃素，受到可見(jiàn)光的照射，產(chǎn)生氧自由基，使玻璃體膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致年齡相關(guān)性液化。Akiba等[14]將核黃素作為光敏劑注射進(jìn)兔眼玻璃體內(nèi)并用白光照射，同時(shí)觀察玻璃體液化情況，結(jié)果顯示玻璃體液化率隨照射時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；SDS-PAGE電泳和高效液相色譜法分析照射后的玻璃體膠原和透明質(zhì)酸分子量的改變，發(fā)現(xiàn)有高分子量復(fù)合物的增加和透明質(zhì)酸分子量的減少。這種現(xiàn)象的產(chǎn)生推測(cè)可能是誘導(dǎo)產(chǎn)生的單態(tài)氧、超氧陰離子等活性氧物質(zhì)使玻璃體膠原相互交聯(lián)和透明質(zhì)酸降解所致[15]。氧自由基清除劑如超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶或甘露醇可明顯抑制這種光誘導(dǎo)的玻璃體液化[14]。玻璃體內(nèi)自身存在的抗氧化防御機(jī)制可以清除H2O2和超氧陰離子等氧自由基。隨著年齡增長(zhǎng)，這種抗氧化的防御機(jī)制降低可引起老年性玻璃體液化。

4 玻璃體液化起始界面

玻璃體液化時(shí)，膠原瓦解及液化腔形成開(kāi)始于黃斑前和玻璃體中心附近[16]。有研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)豐富的不飽和物體在后玻璃體液和視網(wǎng)膜中，顯示這些物體可能會(huì)破壞水-透明質(zhì)酸-膠原纖維網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致玻璃體液化。此外，在視網(wǎng)膜和后玻璃體中檢測(cè)到的磷脂酰膽堿，其更大程度的不飽和率表明，不飽和亞基鏈越大的靈活性越可能會(huì)導(dǎo)致它們?cè)谒?透明質(zhì)酸-膠原纖維的網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行相互作用，從而導(dǎo)致潛在的分子整體結(jié)構(gòu)的液化[17]。在內(nèi)界膜中發(fā)現(xiàn)了XVIII型膠原蛋白，其中一種為內(nèi)抑制素，是一種有效的血管生成抑制劑和蛋白質(zhì)的衍生性片段?；谛∈蟮难芯?，它的功能可能有兩方面：（1）玻璃體纖維和內(nèi)界膜之間的錨定復(fù)合體的一部分；（2）在胚胎時(shí)期玻璃體脈管消失與其有關(guān)。因此，從理論上講，它的存在可能會(huì)抑制PVD及新生血管的生長(zhǎng)[4]。

5 玻璃體液化模型

5.1 動(dòng)物模型 目前誘導(dǎo)玻璃體液化及玻璃體后脫離模型的動(dòng)物有多種，張倩茹[18]在牛眼用胰蛋白酶與膠原蛋白酶中建立了原位與體外牛眼玻璃體液化模型，同時(shí)給予一類(lèi)可以結(jié)合于Ⅱ型膠原和/或透明質(zhì)酸的硫酸軟骨素-蛋白多糖類(lèi)似物，觀察了眼玻璃體的理化性質(zhì)測(cè)定、超微結(jié)構(gòu)觀察與結(jié)構(gòu)重建的研究。李琪等[19]用SD大鼠通過(guò)纖溶酶聯(lián)合透明質(zhì)酸酶最佳組合誘導(dǎo)大鼠的PVD模型。Wu等[20]用兔眼通過(guò)纖溶酶聯(lián)合六氟化硫注射導(dǎo)致完全性PVD。Wang等[21]用兔眼通過(guò)纖溶酶和透明質(zhì)酸酶誘導(dǎo)出兔眼玻璃體液化的模型。孟自軍等[22]用兔眼通過(guò)應(yīng)用軟骨素酶和MMP-3誘導(dǎo)產(chǎn)生灰兔玻璃體液化及PVD的模型。Los[23]發(fā)現(xiàn)全球玻璃體基質(zhì)組織在人與兔眼中相似，是其重要的一個(gè)方面，并隨著年齡的增長(zhǎng)而表現(xiàn)出顯著的形態(tài)變化。解剖和組織學(xué)水平上，人和兔子的玻璃體基質(zhì)成分相似，使兔子成為一種有希望的動(dòng)物模型，以便更詳細(xì)地研究玻璃體基質(zhì)分化和退化的發(fā)病機(jī)理。

5.2 誘導(dǎo)液化酶 文獻(xiàn)報(bào)道有效誘導(dǎo)玻璃體液化及后脫離的酶有很多種。Wu等[20]用纖溶酶聯(lián)合六氟化硫注射導(dǎo)致兔眼玻璃體液化及PVD，認(rèn)為纖溶酶聯(lián)合六氟化硫注射導(dǎo)致完全性PVD，而纖溶酶或六氟化硫單獨(dú)注射只導(dǎo)致部分PVD。李琪等[19]用纖溶酶聯(lián)合透明質(zhì)酸酶注射玻璃體中央部位，誘導(dǎo)大鼠的PVD模型，得出玻璃體內(nèi)聯(lián)合注射0.50 U纖溶酶和5U透明質(zhì)酸酶誘導(dǎo)玻璃體液化和完全性PVD發(fā)生的效果最好。Wang等[21]用纖溶酶和透明質(zhì)酸酶誘導(dǎo)出兔眼玻璃體液化的模型，認(rèn)為兔眼玻璃體注射透明質(zhì)酸酶（20 IU）聯(lián)合纖溶酶（1 IU）可以造成完全性PVD，對(duì)視網(wǎng)膜及其他眼內(nèi)組織無(wú)任何毒性。孟自軍等[22]聯(lián)合應(yīng)用CA和MMP-3誘導(dǎo)產(chǎn)生PVD的實(shí)驗(yàn)，注射在玻璃體中央部位，誘導(dǎo)產(chǎn)生灰兔玻璃體液化及PVD的模型，提出聯(lián)合應(yīng)用CA和MMP-3可在較短時(shí)間內(nèi)成功誘導(dǎo)PVD；兩者有明顯協(xié)同作用，且玻璃體液化和玻璃體視網(wǎng)膜粘連的松解基本同步。以上研究結(jié)果中，纖溶酶聯(lián)合透明質(zhì)酸酶能較好地誘導(dǎo)玻璃體液化及PVD，透明質(zhì)酸酶可以快速降解玻璃體膠原細(xì)纖維間的透明質(zhì)酸多聚體，引起玻璃體液化、凝縮，使玻璃體支架塌陷，有利于纖溶酶快速擴(kuò)散到玻璃體視網(wǎng)膜交界區(qū)。同時(shí)，纖溶酶可降解玻璃體視網(wǎng)膜交界面的纖維粘連蛋白和層粘連蛋白等分子膠。纖溶酶聯(lián)合透明質(zhì)酸酶能誘導(dǎo)玻璃體液化和PVD的發(fā)生，且無(wú)明顯眼內(nèi)毒性[19]。

6 總結(jié)

研究發(fā)現(xiàn)玻璃體液化多起始于黃斑前及玻璃體中心附近，但此方面研究尚少。玻璃體液化與Ⅱ、Ⅴ/Ⅺ和Ⅸ型膠原纖維的液化密切相關(guān)，且導(dǎo)致液化的因子多為透明質(zhì)酸酶、MMP、胰蛋白酶、金屬離子及核黃素等。在玻璃體液化模型構(gòu)建的研究中，多單獨(dú)或聯(lián)合使用透明質(zhì)酸酶、MMP、胰蛋白酶及纖溶酶建立玻璃體液化模型。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，玻璃體液化及后脫離會(huì)導(dǎo)致玻璃體-視網(wǎng)膜界面疾病，而前部玻璃體液化引起玻璃體-虹膜晶狀體隔界面的疾病。但目前在模型構(gòu)建的研究中大多為玻璃體中后部模型，對(duì)前部玻璃體液化模型及前部玻璃體與之相鄰組織結(jié)構(gòu)之間關(guān)聯(lián)的研究極少。因此，完善玻璃體液化模型的構(gòu)建，對(duì)進(jìn)一步研究玻璃體液化的病理生理機(jī)制及玻璃體液化相關(guān)的眼內(nèi)疾病的發(fā)病機(jī)制非常重要，能為玻璃體相關(guān)性疾病的診斷及防治提供新的思路和方法。

[1] 趙燕,楊紅.玻璃體的超微結(jié)構(gòu)與年齡相關(guān)性改變的研究進(jìn)展[J].國(guó)際眼科雜志,2011,11(7)：1179-1181.

[2] Norlen L,Oktem O,Skoqlund U.Molecular cryo-electron tomography of vitreoustissuesections：currentchallenges[J].Journal of Microscopy,2010,235(3)：293-307.

[3] Bishop PN,Holmes DF,Kadler KE,et al.Age-related changeson thesurfaceof vitreous collagen fibrils[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(4)：1041-1046.

[4] Theodorus L,Marja J,Roelofje J,et al.Collagen distribution in the human vitreoretinal interface[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(9)：4089-4095.

[5] Vaughan-Thomas A,Glbert SJ,Duance VC.Elevated levelsof proteolytic enzymes in the aging human vitreous[J].Invest Ophthalmol VisSci,2000,41(11)：3299-3304.

[6] Symeonidis C,Papakonstantinou E,Androudi S,et al.Interleukin-6 and thematrix metalloproteinaseresponsein thevitreous during proliferative vitreoretinopathy[J].Cytokine,2011,54(2)：212-217.

[7]Baramova EN,Bajou K,Remacle A,etal.Involvement of PA/plasmin system in the processing of pro-MMP-9 and in the second step of pro-MMP-2 activation[J].Febs Letters,1997,405(2)：157-162.

[8] Lopez-Lopez F,Rodriguez-Blanco M,Gómez-Ulla F,et al.Enzymatic vitreolysis[J].Curr Diabetes Rev,2009,5(1)：57-62

[9]Bishop PN,Holmes DF,Kadler KE,et al.Age-related changeson thesurfaceof vitreous collagen fibrils[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2004,45(4)：1041-1046.

[10]Moilanen M,Sorsa T,Stenman M,et al.Tumor-associated trypsinogen-2(trypsinogen-2)activates procollagenases(MMP-1,-8,-13)andstromelysin-1(MMP-3)and degradestype Icollagen[J].Biochemistry,2003,42(18)：5414-5420.

[11]Sorsa T,Salo T,Koivunen E,etal.Activation of type IV procollagenasesby human tumor-associated trypsin-2[J].Journal of Biological Chemistry,1997,272(34)：21067-21074.

[12]Stenman M,Ainola M,Valmu L,et al.Trypsin-2 degrades human type II collagenand isexpressed and activated inmesenchymally transformed rheumatoid arthritis synovitis tissue[J].Am J Pathol,2005,167(4)：1119-1124.

[13]Chattopadhyay D,Akiba J,Ueno N,et al.Metal ioncatalyzed liquefaction of vitreousby ascorbic acid：roleof radicalsand radical Ions[J].Ophthalmic Research,2012,24(1)：1-7.

[14]Akiba J,Ueno N,Chakrabarti B.Mechanismsof photo-induced vitreous liquefaction[J].Current Eye Research,1994,13(7)：505-512.

[15]Takahashi K,Arai K,Hayashi S,et al.De gree of degraded proteoglycan in human vitreousand theinfluence of peroxidation[J].Nihon Ganka Gakkai Zasshi,2006,110(3)：171-179.

[16]Schneider EW,Johnson MW.Emerging nonsurgical methods for the treatment of vitreomacular adhesion：a review[J].Clin Ophthalmol,2011,5(default)：1151-1165.

[17]Schnepf A,Yappert MC,Borchman D.Regional distribution of phospholipidsin porcine vitreous humor[J].Experimental Eye Research,2017,160：116-125.

[18]張倩茹.眼玻璃體的理化性質(zhì)測(cè)定、超微結(jié)構(gòu)觀察與結(jié)構(gòu)重建的研究[D].浙江大學(xué).2014.

[19]李琪,韓靜,嚴(yán)宏.纖溶酶聯(lián)合透明質(zhì)酸酶最佳組合誘導(dǎo)玻璃體后脫離的研究[J].眼科新進(jìn)展,2010,30(11)：1005-1008.

[20]Wu WC,Liu CH,Chen CC,etal.Efficient vitreolysisby combining plasmin and sulfur hexafluoride injection in a preclinical study in rabbit eyes[J].Mol Vis,2012,18(249)：2361-2370.

[21]Wang LF,Ma JX,Liu JZ,et al.An experimental study on dissolving and detaching vitreoretinal interfacewith enzymes[J].Chinese Journal of Ophthalmo logy,2004,40(7)：459-464.

[22]孟自軍,曾水清.聯(lián)合應(yīng)用軟骨素酶和基質(zhì)金屬蛋白酶3誘導(dǎo)產(chǎn)生玻璃體后脫離的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華眼科雜志,2004,40(9)：625-631.

[23]Los LI.The rabbit as an animal model for post-natal vitreous matrix differentiation and degeneration[J].Eye,2008,22(10)：1223-1232.